植物DNA的提取及凝胶电泳分析

2010-03-29 17:58 · Abraham

一、植物DNA的提取原理 利用基因组DNA较长的特性,可以将其于细胞器或质粒等小分子DNA分离。当加入一定量的异丙醇或乙醇,基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中,可用玻璃棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到分离提取的目的。分离基因组D

一、植物DNA的提取原理

利用基因组DNA较长的特性,可以将其于细胞器或质粒等小分子DNA分离。当加入一定量的异丙醇或乙醇,基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团漂浮其中,可用玻璃棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到分离提取的目的。分离基因组DNA应尽量在温和的条件下操作。

二、实验试剂

CTAB 氯仿 乙戊醇 乙醇异丙醇酚NaAcTris碱EDTARnaseA

NaCl等

三、操作步骤

(一)简易提取

1. 在50ml带盖离心管(放在-20度预冷)中加入20ml提取缓冲液I,60℃水浴预热。

2. 水稻幼苗或叶子5~10g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,剧烈摇动混匀,60℃水浴保温30~60分钟(时间长,DNA产量高),不时摇动。

3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀(需带手套,防止损伤皮肤),室温下静止5~10分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。

4. 室温下5000rpm离心5分钟。

5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入一倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

6. 在1.5ml eppendorf 管中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。

7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟,再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上,以帮助溶解。

8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管。

9. 加入5μlRNaseA(10μg/μl),37℃ 10分钟,除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。

10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc 及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,使DNA形成絮状沉淀。

11. 用玻璃捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。

12. 将DNA重新溶解于1 ml TE中,-20℃贮存。

(二)微量提取

1. 取2cm新鲜叶片冰冻研钵中,剪碎加1ml 2XCTAB提取液(预热),研磨,转移至1.5ml离心管。

2. 室温下稍离心30秒。

3. 取400μl上清液于新管中,加酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)400μl,缓慢颠倒混匀,室温下5000g(rpm)离心20分钟。

4. 取上清,加等体积氯仿:异戊醇(24:1)缓慢颠倒混匀,室温下10000g离心5min.

5. 取上清,加2V无水乙醇,缓慢颠倒混匀。静止3min,13000rpm离心5min.

6. 去上清,加70%乙醇中洗管壁,并静止1min,去乙醇,风干。

7. 用50μl TE重悬DNA。

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