植物基因组DNA的快速提取与纯化

2010-03-29 21:09 · Conrad

一、原理 DNA和RNA在真核生物体内都是以蛋白质复合物的形式存在的。动植物组织中的DNA-蛋白质复合物可溶于水或高盐溶液(1M的氯化钠),而微溶于0.14M的盐溶液中;RNA-蛋白质复合物则易溶于0.14M的盐溶液中。利用这一性质,通过离心可将DNA-蛋白质复合物与RNA-蛋

一、原理

DNA和RNA在真核生物体内都是以蛋白质复合物的形式存在的。动植物组织中的DNA-蛋白质复合物可溶于水或高盐溶液(1M的氯化钠),而微溶于0.14M的盐溶液中;RNA-蛋白质复合物则易溶于0.14M的盐溶液中。利用这一性质,通过离心可将DNA-蛋白质复合物与RNA-蛋白质复合物和其它杂质分开。通过氯仿、苯酚或SDS的变性处理,DNA-蛋白质复合物中的蛋白质被沉淀并经离心除去。保留在水相中的DNA通过乙醇或异戊醇沉淀可被回收。本实验方法简单快速,适用于各类植物,不需苯粉、氯仿等有害有机溶剂。结合PCR可用于田间杂种植株大范围的筛选研究。

二、目的

了解分离植物基因组DNA的原理和用途,掌握快速提取植物基因组DNA的基本方法。

三、材料、试剂和器具

1、不同品种的小麦幼苗。

2、样品提取液:20mM Tris-HCl(pH 7.5), 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5%SDS。

3、TE buffer(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA)。

4、异戊醇。

5、无菌水。

6、微量离心管、旋涡混合器、微量离心机。

四、实验步骤

1、取用植物幼嫩的叶片,无菌水冲洗,用吸水纸吸干表面的水分。

2、取一片叶片,放在微量离心管管口,盖上盖子,夹取与管盖大小相等的叶盘于管内。

3、用一圆头玻棒在管内研磨15分钟。

4、加入400ul样品提取液,盖紧盖子,在旋涡混合器上混合5秒钟,室温下抽提10-60分钟,间歇摇动。

5、13000 rpm离心10分钟。

6、将上清液(约300ul)转移到另一干净的离心管中。

7、加入等体积的异戊醇与之混合,室温下放置10分钟。

8、13000rpm离心10分钟,倒掉上清液,加入1ml 70%的冷乙醇。

9、13000rpm离心10分钟,弃去上清液。

10、真空干燥20分钟。

11、加入100ul TE缓冲液,溶解DNA,4℃条件下保存备用。

12、用紫外分光光度计(260nm和280nm)或琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。

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