一、原理
质粒DNA的提取有多种方法，目前常用的有碱变性法、煮沸裂解法、羟基磷灰石柱层析法、酸酚法、两相法、氯化铯－溴化乙锭密度梯度离心法等。本实验采用碱裂解法，其原理是在pH高于12.6的情况下，染色体DNA的氢键断裂，导致双螺旋结构解开而变性，而闭环的质粒DNA由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当pH调至中性时，变性的染色体DNA不能复性，而质粒DNA能迅速恢复到原来的构型。
当用碱性SDS裂解细菌时，SDS使细菌蛋白发生变性而沉淀，NaOH使染色体和质粒DNA变性。经醋酸钾中和后，环状质粒DNA很快复性，保存于溶液中；而大多数变性的染色体DNA不能再复性，通过离心随细胞碎片、蛋白质－SDS钾盐复合物等一起沉淀下来，使两者得以分离。上清液中的质粒DNA、RNA可通过乙醇沉淀而收集。再通过RNA酶处理即可得到纯化的DNA。这种纯化的DNA可以用限制性内切酶快速分析，观察电泳结果，与载体和供体的DNA酶切图谱比较，如有对应的片段，则说明重组质粒转化成功。
二、目的
了解质粒DNA的分子特征，掌握提取质粒DNA的基本原理和方法。
三、材料、试剂及用品
1、大肠杆菌HB101，DH5等其他转化菌珠。
2、含有适当抗生素的LB增养基。
3、GTE液：50mM葡萄糖，25mM Tris-HC1(pH 8.0),10mM EDTA。
4、TE缓冲液。
5、SDS/NaOH溶液：0.2N NaOH, 1%(W/V) SDS,使用前配制。
6、5M醋酸钾溶液(pH 4.8)。
7、95％和70％乙醇。
8、饱和酚。
9、饱和酚氯仿混合物（饱和酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1）。
10、无菌双蒸水。
11、0.5M EDTA (pH 8.0) 溶液。
12、10mg/ml无DNA酶的RNA酶。
13、微量离心管、微量样器、恒温水浴、电泳仪、水平电泳槽。
四、实验步骤
1、在5ml LB培养液中接种一个单菌落，37℃振荡过夜培养。
2、转入1.5ml离心管中，14000rpm，离心5分钟。
3、吸去上清液，加入100ul GTE溶液，室温放置5分钟，使细菌充分悬浮。
4、加入200ul SDS/NaOH溶液，迅速混匀，冰浴5分钟。
5、加入150ul 5M醋酸钾溶液，充分混匀，冰浴5分钟。
6、离心3分钟，使细菌碎片和染色体DNA沉淀。
7、转移上清液到另一个离管中，加2ul 10mg/ml RNA酶混合，37℃温育20分钟。
8、加入等体积的饱和酚混合，13000rpm离心2－3分钟。
9、将上相液转移到另一支离心管中，加等体积的氯仿混合，13000rpm离心2－3分钟。
10、吸取下相液，加入0.8ml 95%乙醇，室温放置2分钟，使核酸沉淀。
11、室温离心10分钟，沉淀质粒DNA。
12、弃上清液，用1ml 70％乙醇冲洗，离心弃去上相液。
13、真空干燥沉淀5－10分钟。加入30ul TE缓冲液，于－20℃保存备用。
14、限制性酶切反应（参见实验https://shiyan.ebioe.com/DNAagarosegel-electrophoresis.htm）。
