核酸的分离与提取是分子生物学研究中最重要的基本技术之一，核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。
核酸分离提取的原则
核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA为单链环状分子；大多生物体内RNA分子均为单链线性分子并具有不同的结构特点，如真核生物mRNA分子多数在3'端带有Poly A结构。
95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。RNA分子主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核中，15%在细胞器中。
分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性（完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求）；②排除蛋白质、脂类、糖类等其它分子的污染（纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度；无其它核酸分子的污染，如提DNA分子时，应去除RNA分子。）
为保证分离核酸的完整性及纯度，应尽量简化操作步骤，缩短操作时间，以减少各种不利因素对核酸的破坏，在实验过程中，应注意以下条件及要求：①减少化学因素对核酸的降解：避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4~10条件下进行；②减少物理因素对核酸的降解：强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，反复冻贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都能明显破坏大分子量的线性DNA分子，对于分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，威胁相对小一些；③防止核酸的生物降解：细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构；DNA酶需要Mg2+、Ca2+的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTA，柠檬酸盐，可基本抑制DNA酶的活性，而RNA酶，不但分布广泛，极易污染，而且耐高温、耐酸碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程的主要危害因素。进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。
核酸提取的主要步骤，无外乎破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。
应用分子生物学技术分析基因组完整结构和功能，首先必须制备纯化的高分子量DNA，真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都可以用来制备DNA。
提取真核基因组DNA的方法由两部分组成：先温和裂解细胞及溶解DNA，使DAN与组蛋白分离，完整地以可溶形式独立分离出来，接着采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其它分子。
真核细胞的破碎有各种手段，包括超声波、匀浆法、液氮破碎法、低渗法等物理方法及蛋白酶K和去污剂温和处理法，为获得大分子量的DNA，避免物理操作导致DNA链的断裂，一般多采用后者温和裂解细胞。
去除蛋白质常用酚、氯仿抽提，反复抽提操作对DNA链机械剪切机会较多，因此有人使用80%甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可得<200kb的DNA片段。
根据不同的实验要求，可选择不同的实验方法制备真核染色体DNA。
核酸的分离与提取是分子生物学研究中最重要的基本技术之一，核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。
核酸分离提取的原则
核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA为单链环状分子；大多生物体内RNA分子均为单链线性分子并具有不同的结构特点，如真核生物mRNA分子多数在3'端带有Poly A结构。
95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。RNA分子主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核中，15%在细胞器中。
分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性（完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求）；②排除蛋白质、脂类、糖类等其它分子的污染（纯化的核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度；无其它核酸分子的污染，如提DNA分子时，应去除RNA分子。）
为保证分离核酸的完整性及纯度，应尽量简化操作步骤，缩短操作时间，以减少各种不利因素对核酸的破坏，在实验过程中，应注意以下条件及要求：①减少化学因素对核酸的降解：避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4~10条件下进行；②减少物理因素对核酸的降解：强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，反复冻贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都能明显破坏大分子量的线性DNA分子，对于分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，威胁相对小一些；③防止核酸的生物降解：细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构；DNA酶需要Mg2+、Ca2+的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTA，柠檬酸盐，可基本抑制DNA酶的活性，而RNA酶，不但分布广泛，极易污染，而且耐高温、耐酸碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程的主要危害因素。进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。
核酸提取的主要步骤，无外乎破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。
应用分子生物学技术分析基因组完整结构和功能，首先必须制备纯化的高分子量DNA，真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都可以用来制备DNA。
提取真核基因组DNA的方法由两部分组成：先温和裂解细胞及溶解DNA，使DAN与组蛋白分离，完整地以可溶形式独立分离出来，接着采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其它分子。
真核细胞的破碎有各种手段，包括超声波、匀浆法、液氮破碎法、低渗法等物理方法及蛋白酶K和去污剂温和处理法，为获得大分子量的DNA，避免物理操作导致DNA链的断裂，一般多采用后者温和裂解细胞。
去除蛋白质常用酚、氯仿抽提，反复抽提操作对DNA链机械剪切机会较多，因此有人使用80%甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可得<200kb的DNA片段。
根据不同的实验要求，可选择不同的实验方法制备真核染色体DNA。
方案一 组织细胞DNA提取（酚抽提法）
【原 理】
将分散好的真核生物组织、细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质。破坏细胞膜、核膜，SDS可使组织蛋白与DNA分子分离，EDTA能抑制细胞中DNase的活性，使DNA分子完整地以可溶形式存在于溶液中，再用酚、氯仿/异戊醇抽提除去蛋白质，（氯仿可除去DNA溶液中微量酚的污染，异戊醇还可减少蛋白质变性操作过程中产生气泡）得到的DNA溶液经乙醇沉淀进一步纯化，为获得高纯度DNA，操作中常加入RNase除去RNA，此法可获得100~200kb的DNA片段，适用于构建真核基因组文库，Southern blot分析。
【试 剂】
1、组织细胞裂解液
100~200μg/ml 蛋白酶K
10mmol/L Tris－Cl（pH8.0）
0.1mol/L EDTA (pH8.0)
0.5% SDS
20 μg/ml RNase A
2、平衡酚（用0.5mmol/LTris－Cl饱和，pH8.0），
3、氯仿/异戊醇（24：1v/v）
4、3mol/L乙酸钠（NaAc，pH5.2）
5、冷无水乙醇（AR）
6、70%乙醇（-20℃静置）
7、TE缓冲液（10mmol/L Tris－Cl、1mol/L EDTA (pH8.0)
【操作步骤】
1、根据样品类型，采用以下方法之一作为步骤1：
a、细胞样品贴壁培养细胞约107个，用冰预冷的Tris缓冲液（TBS，见附录）冲洗2次，以细胞刮棒收集于TBS中。离心1500g×10min，弃上清。或用胰酶消化后再离心收集，以TE（pH8.0）重悬细胞离心洗涤1~2次，悬浮生长的细胞，于4℃1500g离心10min收获细胞，以TBS重悬细胞离心洗涤1~2次。
b、组织标本取新鲜或冰冻组织块0.3~0.5cm3，剪碎，加TE缓冲液400μl进行匀浆，转入1.5mlEp管中，加等体积2×组织细胞裂解液混匀。或从液氮中取出组织于陶瓷研钵中，加少许液氮研碎，将粉末转入1.5mlEp管。（液氮操作，应注意保护眼、手以免冻伤）。
c、血液标本新鲜血液与ACD抗凝剂按6：1进行混匀，0℃以下可保存数天或-70℃长期冻贮、备用。
ACD抗凝剂配方：柠檬酸 0.45g
柠檬酸钠 1.32g
右旋葡萄糖 1.47g
抗凝血离心1500g×10min，弃上清（血浆）（冷藏血液于水浴中融化后用等体积PBS稀释，离心3500g×15min弃上清）。
2、将以上各种来源的组织加组织细胞裂解液400~500μl，混匀于37℃温浴12h~24h，或37℃温浴1h后转50℃水浴3h（裂解细胞、消化蛋白），并经常摇动。
3、反应液冷却至室温加500μl平衡酚，缓慢颠倒10min混匀。
4、离心5000g×15min，转上层水相于新Ep管中，（必要时重复酚抽提一次）。
5、加氯仿/异戊醇（24:1）450μl，混匀后离心5000g×10min。
6、转上层水相于新Ep管中，加1/10体积3mol/LNaAc和2.5倍体积无水乙醇，混匀，置-20℃1h。
7、离心10000g×15min，弃上清。
8、以70%冷乙醇洗涤1~2次，真空抽干或自然吹干，（勿使DNA沉淀完全干燥，否则极难溶解，加热可促其溶解）。
9、沉淀溶于100μl缓冲液，置-20℃保存。
【注意事项】
1、所配试剂pH要准确，否则影响结果，酚的pH值必须接近8.0，以防离心后DNA滞留于水酚双相的交界面（主要为蛋白质）上。
2、蛋白酶K在正式使用前应作预试验，明确其活性大小。
3、测定DNA样品在260nm和280nm处的光吸收，A260/A280之比应大于1.75，低于此值则表明制备物中存留有显著量的蛋白质。
4、对于细胞裂解中加入较高浓度的胰RNaseA（20μg/ml）是考虑到0.5%SDS的存在，使RNase不处于最高活性状态。在细胞裂解时加入RNase，可省去传统方法中DNA抽提后再加RNase处理的步骤。
5、DNA抽提液中的EDTA浓度宜为0.1mol/L，可有效抑制DNA酶且易与酚分层。
方案二 外周血白细胞DNA提取（NaI法）
【原 理】
从全血制备白细胞DNA，可用双蒸水溶涨红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核，使核酸处于易提取状态，加NaI破核膜并使DNA从核蛋白中解离，用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全（异戊醇去泡沫），DNA存在于上层水相中，以37%异丙醇沉淀DNA，离心弃去异丙醇，并重复操作一次，即可获得白细胞DNA。用NaI法提取白细胞中的DNA可用于Southern杂交、PCR等。
【试剂及配制】
1、6mol/LNaI
配制：0.75gNa2SO3溶于40mlddH2O加45gNaI，并搅拌至完全溶解（约30min），用Whatman滤纸过滤，避光保存可达3~4个月。
2、氯仿/异戊醇（24:1V/V）混合液，应装密封瓶中保存。
3、异丙醇（isopropanol）（AR）
4、37%异丙醇
5、双蒸水（ddH2O）（高压灭菌）
6、1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）（pH8.0）
称取121.14克Tris溶于800ml双蒸水中，并加浓HCl约42ml，使溶液冷至室温，调正pH至8.0后，定容至1L，分装，高压灭菌。
7、0.5mol/L乙二胺四乙酸钠盐（EDTA-Na2）（pH8.0）
称取186.10克EDTA-Na2·2H2O溶于800ml水中，用NaOH调至pH8.0后，定容至1L，分装，高压灭菌。
8、TE缓冲液（pH8.0）（10mol/L Tris-Cl、2mmol/LEDTA）
取上述试剂6（1mol/L Tris）10ml，试剂7（0.5mol/LEDTA）2ml加双蒸水至1L混匀，高压灭菌。
【操作步骤】
1、取新鲜抗凝血100μl置Eppendorf（Ep）管中，离心10000rpm×1min。
2、弃上清，加ddH2O200μl，摇匀20sec。
3、加6mol/LNaI200μl，缓慢倒置摇匀20sec。
4、于管内加氯仿/异戊醇（24：1）400μl，摇匀20sec，离心12000rpm×12min
5、吸取上层水相360μl置一新Ep管中，加纯异丙醇200μl，摇匀20sec
6、室温放置15min，离心14000rpm×12min
7、小心弃去上清，再加37%异丙醇1ml（勿摇动），离心14000rpm×12min
8、小心弃去异丙醇，晾干。
9、加50μlTE缓冲液溶解DNA，以琼脂糖凝胶电泳鉴定或-20℃保存。
【注意事项】
1、标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管，吸嘴等器物及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进行。
2、混匀试剂、吸取上清等操作时应避免动作剧烈。
3、弃异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丢失。
4、0.54~1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA、rRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件下放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要70%的乙醇漂洗DNA沉淀物。
