生物性检材的DNA 分离是DNA 分型的第一步，是保证后期实验成功与否的关键环节。 DNA 存在于细胞内，首先利用各种方法（高渗或低渗法）破坏细胞的完整结构，通过离心收集细胞核，在蛋白酶K、SDS 作用下，消化破裂细胞膜与核膜，核蛋白变性并降解，使 DNA 从核蛋白中游离出来，然后用不同的方法进行抽提，其主要的目的是去除蛋白质、脂类、多糖、RNA 以及检材载体，以得到较纯的DNA。
方法一：有机溶剂提取法
【实验原理】
DNA 易溶于水，不溶于有机溶剂，而蛋白质在有机溶剂存在时变性沉淀。利用核酸和蛋白质对酚和氯仿变性作用的反应性不同分离核酸与蛋白质后，在高盐存在下用乙醇沉淀收集DNA。
【实验试剂】
1．4%枸橼酸钠抗凝剂 2．0.2%盐水
3．STE 缓冲液 4．10%SDS
5．蛋白酶K (20mg/ml) 6．饱和酚
7．氯仿 8．70％及100％乙醇
9.3mol/L 醋酸钠 10.无菌去离子水
11.TE 缓冲液
【实验仪器】
高速离心机、电热恒温水浴、注射器、离心试管、止血带、微量移液器、Tip 头、1.5ml Eppendorf 管
【实验方法】
1.样品处理
（1）血液样品
① 将抗凝血以2000~3000rpm 离心10min；吸取白细胞层约0.2ml 移入1.5ml Eppendorf管中，加入0.2%盐水1ml，混匀，使红细胞溶解，10000rpm 离心10min，弃去上层血红蛋白溶液，白细胞沉淀于管底。重复此步骤至血红蛋白溶液层为透明，弃上清。
② 沉淀的白细胞中加入1mlSTE，混匀，10000rpm 离心10min，吸去上层STE 至剩余总体积约为0.5ml。
注意事项：根据血液量调整消化提取体积。
（2）血痕样品
① 取适量血斑连同载体剪碎，置于试管中。
② 加适量无菌水（以检材全部浸湿，检材表面还保留有1~2mm 左右高度的溶液层为宜）浸泡10min。10000rpm 离心10min，弃上清。
③ 加入适量STE 液悬浮沉淀物（终体积约为0.5ml）。注意事项：若检材陈旧可适当延长浸泡时间。含杂质很多的检材，可用酚、氯仿进一步提取，用G-50 过柱，或用microcon 纯化试剂处理。
（3）软组织样品
① 先将组织用灭菌去离子水、乙醇冲洗灭菌。
② 取10~20g 组织剪碎，加入2ml STE，用匀浆器研磨制成单个细胞匀浆。
注意事项：为减轻机械剪切力对DNA 的损伤，应尽量温和操作，缩短均浆时间。
2.消化
处理后的样品中加入1/10 体积的10%SDS 和1/20 体积的20mg/ml 的蛋白酶K，使终浓度分别为1%和100μg/ml，置于55℃温水浴中3～4h。
注意事项：消化的温度也可以是37℃过夜。
3.DNA 抽提
消化完全后，用等体积的酚、酚/氯仿、氯仿各抽提DNA 一次：
（1）加入等体积的饱和酚，温和地上下颠倒混合，将管内溶液混合成乳状液。10000rpm离心10min。
（2）转移上层水溶液到另一Eppendorf 管，加入1/2 体积的酚和1/2 体积的氯仿，混匀，10000rpm 离心10min。
（3）转移上层水溶液到另一Eppendorf 管，加入等体积的氯仿，混匀，10000rpm 离心10min。
注意事项：酚抽提时如果上清液太粘，不能和蛋白质分开，可以加适量TNE 稀释，然后再用酚提取；酚具有腐蚀性，氯仿具有神经毒性，操作时必须注意。
4.沉淀DNA
（1）转移上层水溶液到另一Eppendorf 管，加入1/10 体积的3mol/L 醋酸钠和2 倍体积冰冷（-20℃保存）无水乙醇，混匀，沉淀DNA。10000rpm 离心10min。
生物性检材的DNA 分离是DNA 分型的第一步，是保证后期实验成功与否的关键环节。 DNA 存在于细胞内，首先利用各种方法（高渗或低渗法）破坏细胞的完整结构，通过离心收集细胞核，在蛋白酶K、SDS 作用下，消化破裂细胞膜与核膜，核蛋白变性并降解，使 DNA 从核蛋白中游离出来，然后用不同的方法进行抽提，其主要的目的是去除蛋白质、脂类、多糖、RNA 以及检材载体，以得到较纯的DNA。
方法一：有机溶剂提取法
【实验原理】
DNA 易溶于水，不溶于有机溶剂，而蛋白质在有机溶剂存在时变性沉淀。利用核酸和蛋白质对酚和氯仿变性作用的反应性不同分离核酸与蛋白质后，在高盐存在下用乙醇沉淀收集DNA。
【实验试剂】
1．4%枸橼酸钠抗凝剂 2．0.2%盐水
3．STE 缓冲液 4．10%SDS
5．蛋白酶K (20mg/ml) 6．饱和酚
7．氯仿 8．70％及100％乙醇
9.3mol/L 醋酸钠 10.无菌去离子水
11.TE 缓冲液
【实验仪器】
高速离心机、电热恒温水浴、注射器、离心试管、止血带、微量移液器、Tip 头、1.5ml Eppendorf 管
【实验方法】
1.样品处理
（1）血液样品
① 将抗凝血以2000~3000rpm 离心10min；吸取白细胞层约0.2ml 移入1.5ml Eppendorf管中，加入0.2%盐水1ml，混匀，使红细胞溶解，10000rpm 离心10min，弃去上层血红蛋白溶液，白细胞沉淀于管底。重复此步骤至血红蛋白溶液层为透明，弃上清。
② 沉淀的白细胞中加入1mlSTE，混匀，10000rpm 离心10min，吸去上层STE 至剩余总体积约为0.5ml。
注意事项：根据血液量调整消化提取体积。
（2）血痕样品
① 取适量血斑连同载体剪碎，置于试管中。
② 加适量无菌水（以检材全部浸湿，检材表面还保留有1~2mm 左右高度的溶液层为宜）浸泡10min。10000rpm 离心10min，弃上清。
③ 加入适量STE 液悬浮沉淀物（终体积约为0.5ml）。注意事项：若检材陈旧可适当延长浸泡时间。含杂质很多的检材，可用酚、氯仿进一步提取，用G-50 过柱，或用microcon 纯化试剂处理。
（3）软组织样品
① 先将组织用灭菌去离子水、乙醇冲洗灭菌。
② 取10~20g 组织剪碎，加入2ml STE，用匀浆器研磨制成单个细胞匀浆。
注意事项：为减轻机械剪切力对DNA 的损伤，应尽量温和操作，缩短均浆时间。
2.消化
处理后的样品中加入1/10 体积的10%SDS 和1/20 体积的20mg/ml 的蛋白酶K，使终浓度分别为1%和100μg/ml，置于55℃温水浴中3～4h。
注意事项：消化的温度也可以是37℃过夜。
3.DNA 抽提
消化完全后，用等体积的酚、酚/氯仿、氯仿各抽提DNA 一次：
（1）加入等体积的饱和酚，温和地上下颠倒混合，将管内溶液混合成乳状液。10000rpm离心10min。
（2）转移上层水溶液到另一Eppendorf 管，加入1/2 体积的酚和1/2 体积的氯仿，混匀，10000rpm 离心10min。
（3）转移上层水溶液到另一Eppendorf 管，加入等体积的氯仿，混匀，10000rpm 离心10min。
注意事项：酚抽提时如果上清液太粘，不能和蛋白质分开，可以加适量TNE 稀释，然后再用酚提取；酚具有腐蚀性，氯仿具有神经毒性，操作时必须注意。
4.沉淀DNA
（1）转移上层水溶液到另一Eppendorf 管，加入1/10 体积的3mol/L 醋酸钠和2 倍体积冰冷（-20℃保存）无水乙醇，混匀，沉淀DNA。10000rpm 离心10min。
（2）弃上清，用70％冷乙醇洗DNA 沉淀，三次。除去液体，室温晾干（或真空抽干），
（3）加适量的TE 液溶解DNA，溶解后的DNA 于4℃保存。
注意事项：沉淀的DNA 凉干时，不宜完全干燥，否则难以溶解。
【实验讨论】
有机溶剂法DNA，应用范围广，适合所有生物性检材，对腐败、陈旧、污染检材及指甲、毛发等无核细胞检材更有效；DNA 纯度高，可用于所有的DNA 分析。
方法二：Chelex-100 提取法
【实验原理】
Chelex-100 是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合多价离子，特别是对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸的条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心除去Chelex颗粒，使其结合的物质与DNA 分离。
【实验试剂】
1.5％Chelex-100 2.蛋白酶K（20mg/ml）
3.无菌去离子水 4.TE 缓冲液
【实验仪器】1
高速离心机、电热恒温水浴、微量移液器、Tip 头、Eppendorf 管
【实验方法】
1.样品处理
（1）血液样品
① 取血液1~5μl，加入1.5ml 离心管，加入纯水1ml，剧烈震荡，室温下放置15min。
② 10000~12000rpm 离心2~3min，弃去上清，收集沉淀。必要时用纯水洗涤1~2 次，
直至无色或色素很少。
（2）血痕样品
① 剪取1~5mm2 血痕检材，置于0.5ml 试管中。
② 加入去离子灭菌水0.2~0.4ml，剧烈震荡，室温下放置15~30min。
③ 12000rpm 离心3min，弃去上清，保留沉淀及载体。
（3）软组织样品
① 将组织于-20℃以下冷冻。
② 用手术刀片刮取1~5g 组织.放入1.5ml 离心管中。
2. DNA 提取
（1）处理后的样品中加入200μl 悬浮好的5%Chelex-100 溶液（软组织检材同时还应加入10mg/ml 蛋白酶K 2~3μl），
（2）在56℃水浴中温浴30min 以上，震荡5~10s。
（3）100℃温浴8min 后，剧烈震荡5~10s。
（4）120000rpm 离心3min，以沉淀Chelex-100 颗粒，上清液可用于PCR 反应。
注意事项：
1.Chelex-100 放置后会沉淀，使用前必须混匀。
2.Chelex-100 法提取DNA 煮沸非常关键，温度和时间要足够。
3.提取的DNA 应在短时间内使用。若放置时间较长，应充分混匀再离心后，取上清液扩增。
【实验讨论】
Chelex-100 法提取DNA，提取过程始终在同一个试管内进行，不涉及转移，减少污染机会，同时也降低了检材的损失，是一个十分简单、快速的方法，很适合微量检材的DNA提取；但本法提取的DNA 纯度不高，仅适用于PCR 反应模板制备。
