DNA定量测定(分光光度法和凝胶电泳法)

2010-04-03 10:51 · Chasel

法医物证检材多种多样,受外界影响千差万别,从中提取的DNA 量也各不相同。因此,在进行DNA 分析前,对样品提取的DNA 的定量分析是十分必要的。 方法一:分光光度法 【实验原理】 分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光源透过

法医物证检材多种多样,受外界影响千差万别,从中提取的DNA 量也各不相同。因此,在进行DNA 分析前,对样品提取的DNA 的定量分析是十分必要的。

方法一:分光光度法

【实验原理】

分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光源透过测试的样品后,部分光源被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度。组成DNA 分子的碱基含有共扼双键,具有吸收紫外线的特性,最大吸收值在波长为250-270nm 之间。这些碱基与戊糖,磷酸形成核苷酸后,使DNA 的最大吸收波长是260nm。核酸浓度与其吸光度成正比。通过测定DNA 样品在260nm 的紫外吸收值,以此可以计算出DNA 样品的浓度,也可以用OD260/OD280 的比值检查核酸的纯度。

【实验试剂】

灭菌水

【实验仪器】

紫外分光光度计、比色杯、刻度移液管、玻璃试管

【实验方法】

1.样品准备:吸取5μl DNA 样品移入试管中,加灭菌水(或0.4mol/L NaOH)至1ml混匀后,注入分光光度计的比色杯中待测。

2.样品测定:一支比色杯为空白对照,分别测定另一比色杯加中稀释样品在波长为260nm 和280mn 时的OD 值。

【结果判定】

1.DNA 样品的浓度:每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同。

双链DNA 浓度= OD260×样品稀释倍数×50/1000。

单链DNA 浓度= OD260×样品稀释倍数×40/1000。

2.DNA 样品的纯度:

OD260/280 比值大于1.8,说明仍存在RNA,可以考虑用RNA 酶处理样品;

OD260/280 比值小于1.6,说明样品中存在蛋白质或酚,应再用酚/氯仿抽提后,以乙醇沉淀纯化DNA。

【注意事项】

1. 测定前应通电20min 使预热。

2. 吸收池的校正:要固定参比杯和样品杯,可在杯的毛玻璃面上写上记号。用盛有参比液的参比杯和样品杯测定吸光度“A0”,样品杯换上样品液后测定的吸光度为“A1”,则校正后的实际吸光度A 为:A= A1-A0 每次操作均需设置对照,在260nm 和280nm 处需校正零点。

3.吸收池使用:①每次检测前后必需将比色杯清洗干净,尤其是盛过蛋白质等溶液,干后形成一层膜,不易洗去,通常杯子不用时可放在 1%洗洁净液中浸泡,去污效果好,使用时用水冲洗干净,要求杯壁不挂水珠,还可以用绸布丝线或软塑料制作一个小刷子清洗杯子。

② 严禁用手指触摸透光面,因指纹不易洗净。严禁用硬纸和布擦拭透光面,只能使用镜头纸和绸布。③ 严禁加热烘烤。急用干的杯子时,可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。

方法二:凝胶电泳法

【实验原理】

DNA 片断可以与溴化乙锭(EB)分子嵌合,这种结合物在紫外灯下显橘红色荧光,其荧光强度与DNA 含量成正比,通过比较样品与系列标准品的荧光强度,可对样品中的DNA进行定量。

【实验试剂】

1.琼脂糖 2.TAB 缓冲液

3.上样缓冲液 4.EB 荧光染色液

【实验仪器】

电泳仪、潜水电泳槽

【操作方法】

1. 凝胶制备

(1)取琼脂糖0.4g,加入20ml 1×TBE 中配制成2%的琼脂糖溶液,加热熔解。

(2)灌制凝胶:将梳子安插在制胶模具上,将温度降至60℃左右的琼脂糖溶液倒入模具中,室温凝固35~40min。轻轻拔去梳子。将模具置于电泳槽中,向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液,没过凝胶约1mm。

2. 加样电泳

(1)将DNA 样品与上样缓冲液按5:1 比例混合后,取5μl 加入凝胶加样槽中。

(2)取一系列浓度不同的标准DNA 样品与指示剂混合后,加入样品槽中。

(3)按5V/cm 的电压进行电泳,根据指示剂泳动的位置判定电泳的距离。

3. 染色显谱

将凝胶小心剥离模具,浸泡在0.5ug/ml 的EB 染液中染色约30min。在紫外灯下观察结果。

【结果判定】

比较样品DNA 与DNA 标准品的荧光强度,计算出待测样品DNA 浓度。

【注意事项】

1.该方法灵敏、快速,适用于微量DNA 浓度测定,但不十分准确。它的强度取决于嵌入碱基的溴化乙锭的多少,而且与DNA 的螺旋程度密切相关,标准品与样品难以完全一致,并且还受其他发光污染物的影响。

2.电泳加样时DNA 取量要准确,否则会造成误差。

3.EB 为强诱变剂,在操作中应特别注意自我保护。

【备注】

1. 指示剂在不同凝胶浓度下相当的DNA 大小

2. 新型荧光燃料GeneFinderTM 具有安全、灵敏等特点,可以作为各种核酸电泳的染色剂。该燃料发射绿光银光,最大发射波长为515nm,可以在紫外凝胶投射仪观测,也可以用可见光凝胶投射仪观测。

关键词: