实验原理
本实验介绍的就是一种快速简便提取植物总DNA的方法:先将新鲜的叶片在液氮中研磨,以机械力破碎细胞壁,然后加入十六烷三甲基溴化铵(简称CTBA,是一种阳离子去污剂)分离缓冲液,使细胞膜破裂,同时将核酸与植物多糖等杂质分开。再经氯仿-异戊醇提取去除蛋白,即可得到适合于酶切的DNA。
试剂和器材
一、试剂
CTBA抽提缓冲液:2%CTBA, 100mmol/L Tris-HCl, pH8.0; 20mmol/L EDTA ; 1.4mol/L
NaCl; 0.2% (v/v)巯基乙醇共100mL:称取2g CTBA, 8.18g NaCl, 0.74g EDTA Na22H2O, 加入10mL 1mol/L的Tris-HCl, pH8.0,0.2mL的巯基乙醇,加水定容至100mL。
TE:Tris/ EDTA缓冲液: 10mmol/L Tris-HCl, pH8.0; 1mmol/L EDTA。
异丙醇;乙醇;氯仿-异戊醇(24:1,V:V);液氮。
二、材料
新鲜植物叶片。
三、器材
研钵;离心机;恒温水浴。
操作方法
1.称取1g新鲜叶片,置于预冷的研钵中,倒入液氮,将叶片研至粉末。
2.将叶片粉末转入一个30mL离心管中。
3。加10mL CTBA抽提缓冲液,轻轻转动离心管使之混匀。于65℃温育10min。加入等体积的氯仿-异戊醇,轻轻颠倒混匀。
4.室温下4000r/min离心10min,回收上层水相。在回收的上层水相中。
5。加入2/3体积预冷的异丙醇(预冷至-20℃),轻轻混匀,置冰箱中放置数小时甚至过夜,使核酸沉淀下来。
6.室温下4000r/min离心10min。
7.小心倒去上清液,用80%乙醇洗涤沉淀物。尽量沥干乙醇,置于真空干燥器内干燥,,称重,计算产率。
8.将DNA沉淀溶于1mL TE中。
注意事项
提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小片段,所以为保证DNA的完整性,各步操作均应较温和,避免剧烈震荡。