一、实验目的
·学习柱离心法纯化质粒DNA
二、实验原理
·离心柱结构：特殊硅基质吸附材料，特异性吸附DNA，而RNA与蛋白质穿过。
在正常情况下，核酸表面覆盖了一层由水分子组成的亲水薄膜，以维持其水溶性。高浓度盐离子的加入破坏了核酸表面亲水薄膜的相对有序排列，形成了疏水环境。在此环境中，核酸与硅胶膜能有效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物则不能结合。
·碱变性抽提的原理是在pH高于12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，破坏了碱基配对，导致双螺旋结构解开而变性，但闭环的质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当pH调至中性时，质粒DNA链迅速恢复到原来构型，仍保存于溶液中。而变性的染色体DNA不能再复性，通过离心，随不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，使两者得以分离。
三、实验器材与试剂
·试剂盒自带溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
·漂洗液、结合缓冲液、洗脱缓冲液、TE buffer
·器材：吸附柱、取液枪、离心机、低压电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪
四、实验步骤
1.培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时;
2.取液体培养液3ml（ 1.5mlX2)于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100ml 溶液I，充分混匀;置冰上;
3.加入150ml 溶液II，加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置1－2min;
4.加入150 m l 溶液III，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min;
5.用台式高速离心机，12000r/min离心10min;
6.吸附柱中加入420ul 结合缓冲液，将步骤5中的上清转移至吸附柱中，盖上收集管的盖子，混匀， 12000r/min离心1min
7.取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管，向吸附柱中加入600ul 漂洗液 , 静置1 min，12000r/min离心30 s；
8.重复步骤7一次
9.取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管， 12000r/min离心2min
10.吸附柱放入一个新的1.5ML离心管，在吸附柱的中央加40ul洗脱缓冲液或 TE buffer,室温放置3－5分钟。盖好盖子12000rpm 离心1分钟，收集质粒DNA溶液。
11.取5ul 电泳检查，(100ml凝胶加入5ul 染料)
注：加样时要排出枪头中的空气，以免搅动液面
一、实验目的
·学习柱离心法纯化质粒DNA
二、实验原理
·离心柱结构：特殊硅基质吸附材料，特异性吸附DNA，而RNA与蛋白质穿过。
在正常情况下，核酸表面覆盖了一层由水分子组成的亲水薄膜，以维持其水溶性。高浓度盐离子的加入破坏了核酸表面亲水薄膜的相对有序排列，形成了疏水环境。在此环境中，核酸与硅胶膜能有效结合，而蛋白质、代谢产物和其他污染物则不能结合。
·碱变性抽提的原理是在pH高于12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，破坏了碱基配对，导致双螺旋结构解开而变性，但闭环的质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当pH调至中性时，质粒DNA链迅速恢复到原来构型，仍保存于溶液中。而变性的染色体DNA不能再复性，通过离心，随不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，使两者得以分离。
三、实验器材与试剂
·试剂盒自带溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
·漂洗液、结合缓冲液、洗脱缓冲液、TE buffer
·器材：吸附柱、取液枪、离心机、低压电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪
四、实验步骤
1.培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时;
2.取液体培养液3ml（ 1.5mlX2)于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100ml 溶液I，充分混匀;置冰上;
3.加入150ml 溶液II，加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置1－2min;
4.加入150 m l 溶液III，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min;
5.用台式高速离心机，12000r/min离心10min;
6.吸附柱中加入420ul 结合缓冲液，将步骤5中的上清转移至吸附柱中，盖上收集管的盖子，混匀， 12000r/min离心1min
7.取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管，向吸附柱中加入600ul 漂洗液 , 静置1 min，12000r/min离心30 s；
8.重复步骤7一次
9.取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管， 12000r/min离心2min
10.吸附柱放入一个新的1.5ML离心管，在吸附柱的中央加40ul洗脱缓冲液或 TE buffer,室温放置3－5分钟。盖好盖子12000rpm 离心1分钟，收集质粒DNA溶液。
11.取5ul 电泳检查，(100ml凝胶加入5ul 染料)
注：加样时要排出枪头中的空气，以免搅动液面
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12.电泳结束后（溴酚蓝走到胶的正中位置附近），将凝胶拿到成像系统中拍照。
五、实验结果
·由近到远各条带分别显示：环状DNA、线性DNA、超螺旋DNA、RNA
但是DNA各条带显示并不十分清晰，也不是全部都可以看到，这可能与加样时的操作未能使得所有样都 进入沟槽中有关。
注：用柱离心法纯化的质粒DNA没有RNA的显示
·原因分析：特殊硅基质吸附材料可以特异地吸附DNA，RNA则会穿过，被基本去除，而实验一的离心法在吸取水层时或多或少会吸取到下面的有机层，使得 最后得到的物质中有RNA的存在。
六、实验讨论
·分离纯化质粒DNA的方法很多，通常是利用它与细菌染色体DNA在特性和构型上的不同而进行的。目前常用的有碱变性法、煮沸裂解法、羟基磷灰石柱层析法、酸酚法、两相法以及氯化艳-溴化乙锭密度梯度离心法。这些方法各有特点，但它们都含有以下三个基本步骤，即：①培养菌体和扩增质粒；②收获和裂解菌体；③纯化质粒DNA。
·在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在.在提取质粒过程中,除了超螺旋DNA外,还会产生其它形式的质粒 DNA.如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA,简称 ocDNA);如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA).当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。
·该方法抽提质粒主要的试剂为溶液I,II和III,其在抽提质粒DNA中的作用如下:
溶液I:由葡萄糖,EDTA,Tris Cl组成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒DNA;EDTA的作用是络和掉Mg2+等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用;Tris Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适pH范围。
溶液II:由SDS与NaOH组成。SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性;NaOH(pH>12)的作用是破坏氢键,使DNA分子变性。
溶液III:由KAc与HAc组成,是pH值为5.5的高盐溶液.能中和溶液II的碱性,使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒DNA复性。K离子会与 SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质,很容易与小分子的质粒DNA分离,此外,高盐溶液也有利于各种沉淀的形成。
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