相关知识
质粒(Plasmid) ：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
蓝白斑筛选：
现在常用的质粒载体上都带有β-半乳糖激酶（LacZ）基因。载体上重组DNA的插入位点存在于特定遗传标记内部，外源DNA片段的插入会导致该遗传标记失活。本实验使用的载体含一个大肠杆菌DNA的小片段，其中含乳糖操纵子的启动子和β-半乳糖激酶基因，多克隆位点位于其编码区内。载体与编码β-半乳糖激酶C端的部分序列的宿主之间发生互补——α-互补，产生完整的β-半乳糖激酶活性的Lac+细菌。它们在生色底物存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入多克隆位点时，细菌不能产生β-半乳糖激酶，即使有生色底物存在，一般也会产生白色菌落。而无插入片段的重组细胞菌落将产生蓝色菌落。X-gal和IPTG是被用于鉴别蓝白菌落的底物，常涂布于固体培养基上。
质粒提取方法：
细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解可采用多种方法。这些方法包括用非离子型或离子型去垢剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。在实际操作中，可根据所使用的宿主菌及质粒的特性来选择合适的方法。本实验所介绍的碱裂解法提取质粒的方法是一种简便、快捷、效率高、消耗少的方法，适合于小量及大量、质粒的提取。其原理是用 EDTA和SDS破坏细胞壁和细胞膜，使质粒DNA分子，多聚核糖体及其他可溶物质从细胞中逐步释放，而染色体DNA分子与细胞碎片缠绕在一起，可经离心与质粒DNA分开。
质粒电泳：
质粒电泳一般采用琼脂糖凝胶电泳。电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便、快速，可以分辨用其他方法所无法分离的DNA片段。此外，直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。少至1-10 ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。电泳后的DNA条带还可以从凝胶中回收，用于克隆操作。
影响DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素有：
1）DNA分子的大小；2）DNA的构象；3）琼脂糖浓度；4）所用电压；5）碱基组成及电泳温度；6）电泳缓冲液的组成。
主要试剂
1. LB（+Amp）培养基
LB液体培养基内加入100mg/mL的氨苄青霉素。
2. 溶液I：50mM葡萄糖；25mM Tris –HCl，pH8.0；10mM EDTA（灭菌）。
溶液II：0.2mM NaOH，1%SDS。
溶液III：3 M乙酸钾，pH5.5（灭菌）。
3. 93.05g EDTA.Na2，8g NaOH ，充分溶解后调pH值至8.0。
4. 1M Tris-HCl（1000 mL）
121.1g Tris，49 mL浓HCl，充分溶解后调pH值至8.0。
5. TE溶液(1000 mL)
10mL 1M Tris-HCl（pH8.0），2mL 0.5M EDTA（pH8.0）（灭菌）。
9. RNA酶溶液
用双蒸水溶解成1mg/mL，在100度水浴15分钟，-20度储存。
10. TAE电泳缓冲液
50×: 242g Tris碱，57.1 mL冰乙酸，100mL 0.5mol/L EDTA (pH8.0)
11. 6×上样缓冲液 （100mL）
2.5mL溴酚蓝，40g蔗糖，37℃溶解。
仪器耗材：
见https://shiyan.ebioe.com/competentcelltransformation.htm
实验步骤
1. 细菌培养
挑单菌落接种到5 mL含有氨苄青霉素的培养基中37℃振荡至对数生长后期。
2. 细菌收集
取3 mL培养液，4000 rpm离心5分钟后倒掉上清液。
3. 质粒提取
1）加100 μL预冷的溶液I，涡旋悬浮后，在冰上放置5分钟。
2）加200 μL溶液II，轻轻混匀后，冰上放置5分钟。
3）加150 μL溶液III，充分混合后，冰上放置5分钟。
4）4℃，10000 rpm离心15分钟，把上清液移至新管。
4. 抽提
加等体积的氯仿/异戊醇（24:1），混匀，放置片刻。4℃，10000rpm离心10分钟，把上清液移至新管。
5. 质粒沉淀
加入2倍体积的冰乙醇，放置20分钟。4℃，10000rpm离心15分钟，倒弃上清。
6. 洗涤沉淀
加入500 μL，70%的乙醇，洗涤沉淀。
7. 溶解质粒
4℃, 7000 rpm离心5分钟，倒弃上清，真空干燥，加入适量（20 μL）的TE和0.5μL RNA酶溶液。
8. 制备凝胶
称1g琼脂糖，放入250 mL三角瓶内，加入100 mL 1×TAE电泳缓冲液，加热煮沸等其凉到60℃左右，倒入封好的电泳板上。
9. 上样
1）吸取2 μL质粒，加入1μL上样缓冲液（Loading buffer），混匀。
2）将质粒样品点入到琼脂糖凝胶的上样孔中
10. 电泳
连接好电泳槽和电泳仪，以5V/cm恒压电泳。
11. 染色及脱色
电泳1.5-2 h后，关上电泳仪。取出凝胶，放入染色槽内，加入1滴溴化乙锭（EB）轻轻摇荡15分钟。将染色液倒入储存桶内，在染色槽内加入自来水，轻轻摇荡10分钟。
12. 结果观察
将凝胶放到紫外灯下观测。记录观察到的电泳条带
注意事项
1、动作轻柔，不能太剧烈，防止质粒降解。
2、所用耗材灭菌后使用。
3、细胞裂解要放在冰上操作。
4、每一步时间要严格控制。
实验结果与分析
质粒沉淀离心后,在管底能见到少量白色物质。
真空干燥后，无色，贴于管壁。
加ddH2O或TE能迅速溶解。
电泳凝胶上呈现一条亮带。
如果质粒提取中降解，则会出现上下三条带，分别代表超螺旋、带切口和带切刻的质粒。
溶解时不加RNase，则下部会有很亮的一片，为小分子RNA片段。
质粒中含太多杂质，则干燥后会呈白色或褐色，不易溶解。
