[实验原理]
质粒（Plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1—200Kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在基本上不防碍细胞的存活，因此质粒是寄主性的自主复制因子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因带进受体细胞表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质。目前，质粒已广泛地用作基因工程中DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0—12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，由于共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
实验中，在EDTA存在下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解，同时细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核酸酶可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿—异戊醇混合液的抽提可以去除蛋白质等。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程产生的泡沫，并使离心后水层、变性蛋白质层和有机层维持稳定。含有质粒DNA的上清液可用乙醇或异戊醇沉淀，获得质粒DNA。
[仪器、材料与试剂]
(一) 仪器和材料
恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、紫外可见分光光度计、移液枪、Eppendorf管、E.coliDH5α菌株
(二) 试剂
质粒DNA提取试剂盒：
溶液I：50mM 葡萄糖 25mM Tris·Cl (pH8.0) 10mMEDTA (pH8.0)
溶液Ⅱ：0.2M NaOH 1％SDS 用前等体积混合
溶液Ⅲ：5M乙酸钾60mL 冰乙酸11.5mL 水28.5mL
TE缓冲液：10mM Tris·Cl (pH8.0) 1 mM EDTA(pH8.0)
乙醇 70％乙醇(放—20℃冰箱中，用后即放回) LB液体培养基
[实验步骤]
(一) 提取质粒
1、接种一个单菌落于5mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至饱和状态（OD600=4）或过夜。
2、取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r／min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。沉淀用100uL溶液I重悬，充分混匀，室温放置5min。
4、加200uL溶液II(新鲜配制)，盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
5、加入150uL溶液III(冰上预冷)，盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。
6、12000r／min离心5min，将上清0.4mL转至另一离心管中。
7、向上清中加入等体积酚：氯仿(1：1)，反复混匀，12 000r／min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
8、 向上清加人2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5—10min。12 000r／min离心5 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
9、用1 mL 70％乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。
10、加20uLTE缓冲液，使DNA完全溶解，—20保存。
(二)测定DNA浓度与纯度
利用紫外可见分光光度计分别测定在波长260nm处、280nm处DNA的吸光率，然后计算其浓度与纯度。
注：对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量。核酸的比吸光系数是指浓度为1ug/ml的核酸水溶液在260nm处的吸光率，天然状态的双链DNA的比吸光系数为0.020，变性DNA（即单链DNA）和RNA的比吸光系数均采用0.022。
DNA纯度可以A260/A280的比值表示：纯的DNA样品比值为1.8，纯的RNA样品比值为2.0。核酸样品中若含有蛋白质或苯酚等杂质，此比值则显著降低。
