常见问题
具体情况
可能的原因
处理办法
备注
样品准备问题
菌培养不好或失败
抗性不对或菌已死
核对抗性，尽可能提供载体信息。
或菌培养条件特殊
重新提供菌液，或提供2μg纯化质粒。
质粒提不出
质粒拷贝数极低或
客户自己采取大量提取的方法提供2μg纯化质粒。
培养方式不当
质粒产量很低
低拷贝数质粒或
客户自己采取大量提取的方法提供2μg纯化质粒。
培养方式不当
自带质粒或已纯化PCR产物量极低
是否为电泳法定量，
质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul。
测OD值法不可靠,电泳检测
总量是否足够
已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般要求是100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。
测序出现双峰或信号中断
双峰
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复
用反向引物测互补链。
此类问题主要与样品有关
质粒测序在插入序列中出现套峰
可能是样品非单克隆，挑其他测序。
PCR产物测序中，某一点后序列变乱
可能是存在移码突变，这是正常的，也可以后测序。
PCR产物中一个或多个位置有套峰
序列中存在突变，这是正常的，也可以后进行测序。
PCR产物测序前部分双峰
引物二聚体污染或产物不纯，后测序。
质粒测序时整个结果双峰
引物特异性不好，序列中存在通用引物的同源序列；改用其他引物测序。
质粒和PCR产物测序出现双峰
引物不纯，测序时只要单一引物，请不要将双向PCR引物混合；合成的引物没有纯化，或纯化不好。重新合成引物测序。
信号迅速衰减或中断
模板GC二级结构区后
难以得到好的测序结果，亚成较小的片段进行测序
模板GT二级结构区后
测反向互补序列，AC结构不影响测序
严重的重复结构
测反向互补序列
模板特性决定的
根据具体情况决定
信号极弱或无信号
模板质量差
重新提供菌液或纯化PCR产物
质粒样品：引物不符
尽量提供载体详细信息，核查引物
引物不适宜测序
测序引物比PCR引物要求高，随机引物和简并引物不能用于测序，较长的PCR引物也不能用于测序。重新设计引物测序，对PCR产物而言建议到载体上用通用引物进行测序
质粒产量极低
客户自己提供2μg纯化好的质粒
PCR产物定量极低
重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化
测序结果正常，与预期不符
找不到引物
质粒模板
检测是否为空载体，从其互补链上寻找，位点离测序引物太近，长插入片段未测通。
PCR模板
不可能找到所用的测序引物，短片段可以从互补链上找到另一段的引物，长片段由于测不通，无法找到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经后进行测序。
结果完全不对
请提供详细资料我们会根据结果具体分析。
