滕晓坤①, 肖华胜①②*
① 生物芯片上海国家工程研究中心, 上海 201203;
② 国家人类基因组南方研究中心, 上海市-科技部共建疾病与健康基因组学重点实验室, 上海 201203
摘要 基因芯片与第二代DNA测序是两种重要的高通量基因组学研究技术, 对于揭示基因组的结构与功能已经并正在发挥重要的推动作用. 基因芯片技术建立了10多年, 技术日渐成熟, 在功能基因组、系统生物学、药物基因组的研究中已经得到了广泛的应用. 2003年, 454公司首先建立了高通量的第二代测序技术, 其他公司相继推出了Solexa和Solid测序技术. 虽然第二代测序技术建立的时间不长, 但发展非常快, 已经应用于基因组, 包括测序和表观基因组学以及功能基因组学研究的许多方面. 本文简要综述了基因芯片和第二代测序技术及其应用进展, 并分析了这两种高通量基因组学技术的前景.
关键词：基因芯片 第二代高通量测序技术 基因组
20世纪80年代启动的由多个国家参加的人类基因组计划, 被称为是继曼哈顿原子计划、阿波罗登月计划之后的第三大科学计划, 这个计划的完成对人类认识自身, 提高健康水平, 推动生命科学、医学、生物技术、制药业、农业等的发展具有极其重要的意义. 2000年6月26日由美国、英国、法国、德国、日本和中国科学家同时向世界宣布人类基因组工作草图已基本完成, 2002年2月又公布了“精细图”. 这是基因组学研究领域的一个里程碑式的工作. 随着人类基因组计划的实施, 也推动了模式生物基因组的测序, 在这期间还完成了大鼠、小鼠、水稻等物种的测序. 众多物种的基因组序列被解开, 大量的基因通过基因组测序被识别, 接下来的工作是要对这些基因的结构、功能、表达和分布进行深入的研究, 急需高通量、大规模的分析手段和方法来解决这些需求. 20世纪90年代建立起来的基因芯片技术和最近发展起来的第二代DNA测序技术是高通量研究基因的结构和功能的两种比较重要的技术, 推动了功能基因组和系统生物学研究的发展. 本文简要介绍了这两种技术和应用, 并对这两种技术在生命科学中的应用前景进行了分析.
1 基因芯片技术及其发展
生物芯片的概念由Fodor等人在1991年提出[1], 是指能够快速并行处理多个样品并对其所包含的各种生物信息进行解剖的微型器件, 它的加工运用了微电子工业和微机电系统加工中所采用的一些方法, 只是由于其所处理和分析的对象是生物样品, 所以叫生物芯片(Biochip).
在生物芯片技术中, 基因芯片技术建立最早, 也最为成熟. 基因芯片, 又称DNA微阵列(DNA micro- array), 是把大量已知序列探针集成在同一个基片(如玻片、膜)上[2~7], 经过标记的若干靶核苷酸序列与芯片特定位点上的探针杂交, 通过检测杂交信号, 对生物细胞或组织中大量的基因信息进行分析. 其突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化. 高度的并行性不仅可以大大提高实验的进程, 而且有利于DNA芯片技术所展示图谱的快速对照和阅读. 多样性可以在单个芯片中同时进行样品的多参数分析, 从而避免因不同实验条件产生的误差, 大大提高分析的精确性. 微型化可以减少试剂用量和减小反应液体积, 降低实验费用. 高度自动化则可以降低制造芯片的成本和保证芯片的制造质量. 1995年Science杂志首次报道了Schena等人[8]用DNA微阵列技术并行检测拟南芥多个基因的表达水平. 1994年第一张商业化基因芯片由Affymetrix公司推出.
基因芯片的制备方法主要有两种：原位合成法和点样法. 从目前应用的情况来看, 原位合成的基因芯片的密度高, 重复性好, 制备过程中的质量控制比较容易, 但是成本较高. 而点样技术主要应用在部分没有商业化芯片的物种的基因芯片的制备, 制备的成本较低. 原位合成的芯片是今后的一个发展和应用方向.
基因芯片的原位合成法是基于组合化学的合成原理[9], 通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序, 把腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四种不同碱基的核苷酸按不同次序化学偶联在相应的位点, 原位合成序列不同的寡核苷酸探针, 形成DNA芯片. 这一技术是由Affymetrix公司的Fodor及其同事最先发明的[1], 他们使用含光敏化学保护基的DNA合成试剂, 用光脱保护法直接在基片上合成寡核苷酸探针, 即光导向原位合成法. 该方法的优点在于精确性高, 缺点是制造光掩蔽剂既费时又昂贵.
美国Wisconsin大学的Singh-Easson等人利用计算机设计的虚拟掩模来制备DNA芯片, 他们使用一种包括480000个微小铝镜阵列的光学数字微镜设备, 通过计算机精确地控制光线在微镜上的反射方向, 将紫外光束直接照射到玻璃基片上, 从而在基片的特定区域上选择性地脱除保护基. 采用虚拟掩模技术不用耗资费时去加工光掩模, 降低了基因芯片的制备时间和成本[10]. Nimblegen公司利用这一技术进行了高密度芯片的商业化生产.
