唐晔盛1) 3李 英2) 朱静洁2) 胡 欣2) 林志新1) 韩 斌2) 洪国藩2)
( 1) 上海交通大学生命科学技术学院, 上海200240 ; 2) 中国科学院国家基因研究中心, 上海200233)
摘要 一种利用菌落直接PCR 扩增DNA 并用于测序的实验方法. 通过对引物的设计和菌液浓度控制, 使PCR反应后的内容物对测序干扰减到最小. 与传统的测序过程比较, 它省去了抽提模板DNA 一步, 节省了大量时间和实验成本. 另外此方法可对BAC 亚克隆库构建时由连接转化过程中导致的假阳性起筛选和鉴定作用. 采用该法成功测定了籼稻( Oryz a sativa indica) 广陆矮4 号的L3173 号BAC DNA 全长序列(约100 kb) , GenBank 登
录号: AL512542.
关键词 菌落PCR , 水稻基因组, 测序
PCR 技术[ 1 ,2 ] 目前已成功应用于cDNA 扩增, 基因组测序[ 3 ,4 ] , 医疗诊断和突变检测[ 5 ] 等领域, 是当今分子生物学领域一项不可缺少的实验技术手段. 当前基因组大规模测序大体遵循以下步骤: 建库2抽提DNA2PCR 扩增并荧光标记(cycling) 2测序仪自动测序2组装分析.
传统的测序前PCR 扩增是以碱裂解等方法抽提的DNA 为模板, 成功率高, 然而显得较为繁琐, 尤其在用96 孔板抽提DNA 时, 由于当前离心机的最大离心力限制, 4 块96 孔板DNA 的抽提约需近一个小时. 采用菌落PCR 方法, 将样品跳过DNA 抽提这一步, 而直接以菌体热解后暴露的 DNA 为模板进行PCR 扩增和荧光标记(cycling) , 不仅节约了时间, 增加了设备利用率, 同时也降低了实验成本. 该法使建库到测序前各步骤的总成本减少了约三分之一(引物干扰造成的损耗和建库数增加使总成本上升已考虑在内) .
在大规模基因组测序中, 菌落PCR 与传统 PCR 相比更为简单快捷. 此法已成功应用于籼稻 ( Oryz a sativa indica) 广陆矮4 号品种第四号染色体测序, 希望该方法对于国内日益兴起的基因组大规模测序有所帮助.
材料和方法
1.1 材料和试剂
测序用样品取自中国科学院国家基因研究中心水稻( Oryz a sativa indica) 广陆矮4 号L3173 号 BAC 的亚克隆库(2～3kb DNA 片段) .
PCR 反应体系的Taq 酶系购自宝生物工程有限公司( TaKaRa Biotech ) . PCR 引物: R1 :GCCGCTCTAGAACTAGTG, R2 : TAATACGAC2TCACTATAGGG. Cycling 引物R2 : TAATACG2ACTCACTATAGGG引物合成自生工生物有限公司. 测序试剂盒购自PE 公司. 仪器: PTC2200PCR 仪(MJ Research) , ABI377 DNA 自动测序仪(PE Applied Biosystems)
1.2 方法
1.2.1 菌液培养: 200μl 96 孔板, LB 37 ℃静置培养约10 h. 接种菌一般可直接在固体培养基上挑选.
