张晓丹1 武海萍2 周国华#1，2
1（中国药科大学生命科学与技术学院，南京210009） 2（华东医学生物技术研究所，南京210002）
摘 要 焦测序技术是一种新的实时DNA 测序技术。它在DNA 聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4 种酶的协同作用下，使引物延伸聚合脱氧核糖核酸（ dNTP）释放焦磷酸盐（PPi）、PPi 转换三磷酸腺苷（ATP）、ATP 产生荧光信号与dNTP 和ATP 的降解等化学反应偶联起来，检测结果准确可靠。本文综述了焦测序技术的基本原理、操作步骤和它在单核苷酸多态性（SNP）研究、微生物的分型鉴定和基因甲基化检测等遗传分析中的应用，并对焦测序技术的发展作了展望。
关键词 焦测序技术，单核苷酸多态性，等位基因频率，微生物的分型鉴定，基因甲基化，评述
1 引 言
DNA 序列测定技术是现代生命科学研究的核心技术之一。随着分析科学的进步，阵列式毛细管电泳测序技术的发明，使人类基因组计划比原计划提前两年完成［1］。目前普遍使用的DNA 序列分析技术基本都是基于双脱氧核苷酸链终止法（Sanger 法），其原理是以DNA 单链为模板，在一定条件下，用模板特异性引物在DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则，不断将4 种脱氧核糖核苷酸（dNTP）和经不同颜色染料标记的双脱氧核糖核苷酸加到引物的3'-羟基末端并使引物链得到延伸或使延伸终止，得到各种连续长度的DNA 片段，通过电泳分离，用激光诱导荧光法可以检测到各片段末端碱基的种类。通常该法可以测定500 个左右碱基的序列。该方法的主要不足在于：只能定性不能定量；适合大规模测序不适合测定单碱基差异；不能测定引物后面的碱基序列。新发展的焦测序（pyrosequencing）技术［2］可以克服这些缺点，在进行DNA 序列分析时不需要电泳和荧光标记，可以直接测定引物后面的碱基序列，定量性能好，结果准确，可实现自动化。人类进入后基因组时代的主要任务之一就是大规模测定人类基因组的差异（如SNP）与疾病易感性和药物敏感性的关系，寻找基因甲基化与疾病发生发展的关系。因此焦测序技术在后基因组计划中将发挥巨大作用。本文介绍了焦测序技术利用化学反应进行测序的原理，对其在SNP 检测、病原微生物的快速鉴定、基因甲基化分析等方面的应用作了评述。
2 焦测序技术的原理和基本操作
2. 1 焦测序的原理
焦测序技术是一种基于发光法测定焦磷酸盐（PPi）的测序技术［3］。其原理是：引物与模板DNA 退火后，在DNA 聚合酶（polymerase）、三磷酸腺苷硫酸化酶（ATP sulfurylase）、萤光素酶（ luciferase ）和三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）4 种酶的协同作用下完成循环测序反应。当加入的dNTP 与模板互补时， DNA 模板与互补的dNTP 聚合时可以产生等摩尔PPi，在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi 与5'-磷酸化硫酸腺苷（APS）反应生成等量的ATP；在萤光素酶催化作用下，ATP 与虫萤光素（luciferin）反应发光，最大波长约为560 nm，可用光电倍增管（PMT）或电荷耦合装置（CCD）检测。产生的荧光信号强度与聚合的dNTP 个数成正比，根据加入的dNTP 类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA 的核苷酸序列。
在焦测序技术中有3 个关键点：（1）使用dATP 的类似物dATPαS，因为dATP 的结构与ATP 相似，能与荧光素反应发出荧光，而dATPαS 几乎不产生背景荧光。（2）使用三磷酸腺苷双磷酸酶使测序能循环进行，因为每加一种dNTP 时必需除去上一次未反应的dNTP，否则会影响连续测序。三磷酸腺苷双磷酸酶能够在聚合反应完成后降解剩余的dNTP，因此无需用分离或洗涤步骤来除去剩余的dNTP。
