尽管核酸序列测定方法越来越成熟、简便并且可以自动化，但事实上，对于一个片段较长、序列未知的待测核酸而言，仍然是一件耗时且繁琐的工作。对于一个待测DNA分子，要制定一个能够简捷准确的测定方案，一般可以从以下几个方面考虑：
⑴ DNA片段大小。
⑵ 背景资料：是否清楚DNA限制性酶切图谱，是否有一段已知序列，是否具有重复序列等。
⑶ 测序目的：①测定未知序列；②确定重组DNA的方向与结构；③对突变（如点突变）进行定位和鉴定；④比较性研究，如比较同种病毒不同株系之间的基因差异。后3种测序目的称为确证性测序。
⑷ 实验条件：如手工测序还是自动化测序，合成引物费用等。
由于单套测序反应所能准确测定的DNA序列最长一般仅400~500bp。因此，在进行序列测定之前，必须首先考虑待测DNA分子的大小，其次是所要测定的序列范围以及要求的序列精确程度等，再结合实验室的条件选择切实可行的克隆及测序方案。
㈠ 确证性测序策略
多数情况下，测序是对已知序列的次级克隆进行鉴定和证实（即确证性测序），如次级克隆DNA的插入方向、定点突变的检测、删切产物的鉴定和待表达基因阅读框架的调整等。这类DNA片段通常较小，只需了解两端的部分序列即可。所以只需直接克隆到M13mp或者质粒载体中，进行单链或双链模板测序。对于一个稍大的DNA片段的确证性测序，可以利用通用引物分别从两端开始双向测序，再通过中间重迭部分拼出全序列。对于更大的的DNA序列，可以在序列适当区段增加一个或数个测序引物，分别测序再拼出全序列。
㈡ 未知DNA序列的测定策略
未知DNA序列的测定是指确定一个未知序列的准确长度及核苷酸排列顺序。未知DNA序列的测定，复杂而费时。目前已发展了一些可行的策略。
对于较小的目的DNA片段（如小于400bp），可以利用直接利用M13mp或质粒系统（如pUC18等）克隆、测序。随着质粒DNA序列测定技术的改进，目前其测序水平基本上已达到M13mp单链DNA测序水平，利用质粒载体系统具有显著的优势。因此，除非有特殊用途，如体外定点突变，都可以用pUC系统代替M13mp系统进行克隆测序。
如果是数千个碱基的大片段未知序列DNA，且要求精确测定其整个序列，就必需将其切割成适当大小的各个片段（300~400bp）分别进行次级克隆再进行测序，最后拼出全序列。可以考虑以下几种方法：
1． 随机克隆法或称鸟枪法 这是一种传统的方法，即利用DNaseⅠ或超声波，将目的DNA大片段随机切割成小片段，并分别进行亚克隆，然后再测定亚克隆的序列，通过排列分析，可获得目的DNA的全序列。但由于用于测序的克隆是随机挑选出来的，因此某些区段往往被重复测定，有时需要很长时间才能确定最后几个亚克隆的序列而拼出全序列。
2．限制性酶切片段亚克隆法 首先需要对目的DNA进行酶切分析确定其酶切图谱。再选择合适的限制性酶消化以制备各种不同长度的限制性酶切片段，并亚克隆到测序载体上建立亚克隆库。然后分别测定各个亚克隆的核苷酸序列，通过排列分析，即可获取目的DNA的全序列。但实际上应用此法相当不易，仅当目的DNA片段上限制性酶切位点分布较均匀、且片段不大情况下，可考虑用此策略。
3．定向连续次级克隆 大片段未知DNA序列片段的定向连续次级克隆法，亦称嵌套系列缺失突变体法，是目前常用的一种策略，此法具有节省工作量、便于拼读等优点。这些次级克隆具有其同的缺失起点（通常在目的DNA的一端），并逐步延伸到目的序列不同距离。从而使目的DNA中较远距离的序列逐渐地进入了通用引物的测序范围之内。目前，利用核酸外切酶Ⅲ和核酸酶BAL31构建连续次级克隆的方法比较成熟。
