DNA序列的正确测定，是进行基因结构和功能分析，绘制基因图谱、转基因检测等方面工作的重要前提。同时DNA测序技术为快速、简捷分析蛋白序列及结构提供了工具。
DNA序列测定技术是在DNA内切酶、合成酶的应用，基因克隆及亚克隆技术，高分辨率聚丙烯酰胺变性胶电泳技术等基础上建立起来的。这些技术主要有三部分组成，首先为通过各种酶的应用和克隆技术获得一组有相同起点端而终止端在长度上相差一个核苷酸的DNA片段群。其次为通过聚丙烯酰胺凝胶变性电泳，将以上在长度上差一个核苷酸的DNA片段群相互分开。最后是通过放射自显影或化学方法将经变性电泳分开的DNA片段显色。
目前研究人员获得一端相同、另一端差一个核苷酸的途径，主要是采用Sanger(1977)的酶促合成法或Maxam和Gilbert(1977)的化学降解法。在酶促合成法中，人们将待测序列的DNA片段作为模板，以与模板3'端相配对的寡聚核苷酸作为引物，利用Klenow片段、测序酶、Taq酶及AmpliTaq酶等DNA合成酶扩增与模板配对的DNA片段，在扩增过程中，同时进行四组平行实验，每一组中含四种dNTP,和一种ddNTP，这样经过一段时间的扩增，即可获取分别以Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ为结尾的四组由所有可能长度核苷酸片段组成的DNA片段群。在化学降解法中，人们用专一性作用于A,T,G,C碱基的化学药剂分别处理经内切酶切割而成的一定长度DNA片段，通过控制反应时间，既可获得分别以A、T、G、C为结尾的四组由所有可能长度核苷酸片段组成的DNA片段群。在以上两种方法中，除了要研究与DNA的高级结构、DNA－蛋白质结构相关性有关的序列分析时，采用化学降解法外，对于单纯以测序为目的的实验，研究人员用得较普遍的是酶促合成法，在这种方法中，可测DNA片段长度及正确性与所选用的合成酶类型关系极大(详见附表)。在测序工作的早期阶段，人们只能对ssDNA进行测序，因此在进行测序前，必须将待测片段克隆到M13嗜菌体等中，将dsDNA变成ssDNA，并同时使模板量扩增，然后再测序。而近阶段，随着PCR技术的发展，人们可以利用耐热性Taq酶，采用不对称PCR技术，对待测片段在体外完成单链片段的富集和模板扩增，从而可直接测定dsDNA序列。在酶促合成法测序中，影响测序正确性的另一重要因素为引物的选用，实验中所使用引物一般有特异性引物和通用性引物，前者指当待测片段一端的数十个核苷酸序列已知时，即可人工合成与其相配对的一段寡聚核苷酸作为引物。后者为待测片段末端序列未知，但其末端侧翼有通用型载体片段，且此载体片段为某一内切酶的酶切片段，此时即可选用与此片段配对的商品化通用型引物；另外当待测片段侧翼无载体片段时，人们也可通过DNA联接酶和内切酶的协同使用，在其末端添加上与通用型引物配对的一段寡聚核苷酸。引物的具体要求可参考附录。模板的质量及数量也是影响测序结果的一个重要因素。
测序胶是影响测序质量(包括可读性、可读长度、可重复性等)的又一重要因素。不管是酶促合成还是化学降解得到的不同长度核苷酸片段，都必须通过测序胶来区分并显示。一般通过测序胶可读取300-400核苷酸的可靠序列，但如果在相邻样槽中进行时间梯度电泳，即可最多读取500以上核苷酸的序列。测序胶的一些参数影响着测序结果，具体为：
１：胶浓度
高浓度(12-20%)的胶适合读取引物5'端50个核苷酸以内的序列。
低浓度(６％及以下)的胶可读取5'端400以内或更远的核苷酸序列。
２：胶长度 40-50cm
３：胶厚度 0.4mm。小于此，胶上条带分辨效果好，但极难操作，极易破裂；大于此，条带分辨率下降，且胶难固定和干燥。另外，如采用上薄下厚的胶可改善条带上紧下疏的现象。
４：缓冲液 如配胶缓冲液采用梯度性，也可改善条带上紧下疏的现象。
５：胶板温度：要求整个胶板温度均一，保持在50℃上下，以防止DNA形成链间配对，
经胶分离后条带的显色，主要有同位素标记和非放标记两种。从该技术诞生到现在，基本上都采用对核苷酸进行同位素标记，然后放射自显影，不过，现在在标记物选用上多用35S替代32P。考虑到同位素标记的传统测序使用限制了许多研究人员的工作。目前国外一些公司开发出了一些非同位素测序方法。如银染测序法或地高辛标记探针测序法等。本实验即采用银染法进行DNA序列测定。以使学员对测序技术有一初步了解。PCR测序优点在于１)选用耐热性和热稳定性好的Taq酶，采用不对称PCR直接对dsDNA片段测序。在PCR过程中采用较高的复性温度，增加了引物与模板的特异性结合；较高的延伸温度，防止了DNA二结结构的形成。这些保证了结果的正确性和可重复性。2)需用模板量少，ng-μg级即可。以PCR反应为基础的龈染测序有PCR测序的优点，有不用同位素标记的长项，但也有无法克服的缺陷1)模板及引物纯度要求极高，PCR反应的参数要求较严；2)电泳后步骤要求比较严，略有差错，实验将全盘失败;3)，实验对化学试剂及水的质量要求极高，实验结果与操作经验的相关性极大。
一：仪器:
离心机,PCR仪,高压电泳仪, 测序槽 ,摇床 ,染色,脱色缸
易生物仪器库：https://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库：https://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
二：试剂：
测序反应试剂 ,硝酸银,硫代硫酸钠,碳酸钠,37％甲醛,冰乙酸，乙醇,硅化及反硅化试剂
固定/终止液：１０%冰乙酸
染色液：混合２g硝酸银，3ml 37%的甲醛于２l超纯水中
显影液：在２l超纯水中溶解60g碳酸钠，冷却至10-12℃，临用前再加入3ml 37%甲醛，400μl 硫代硫酸钠(10mg/ml)。现配现用。
三：操作
（一）：测序反应操作
1：标记4个0,5ml的微量离心管(G.A.T.C)，每管加入２μl相应的d/ddNTP混合物，盖上盖子，保存于４℃或冰浴备用。
2：另外准备离心管按下表分别加入各种试液
任意模板平端 克窿到PGEM载体多克窿位点区的DNA
５×测序缓冲液 ５μl ５×测序缓冲液 ５μl
模板DNA fmol-pmol PGEMDNA(4μg) 4μl
特异性引物(4.5pmol) 3.6ul pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6μl
加水到终体积 １６μl 加水到终体积 １６μl
３：在上述２的模板/引物混合物中加入1μl测序级Taq酶(5μ/μl)，用移液器抽吸几次混匀。
４：从上述３中吸取４μl分别加入１中准备好的四组d/ddNTP混合液的离心管中。
５：在台式离心机中离心，使各试剂混合并沉降于管底。
６：在每管中加入一滴矿物油。
７：PCR反应，具体参数如下
95℃预变性 ２min 95℃(变性) 45秒 42℃(退火) 45秒 70℃(延伸) 60秒 60循环 70℃(延伸) 10min（注意：反应参数随PCR仪不同、引物不同有较大变化）
８：PCR结束后，在每管中加入3μl DNA测序中止液(在加入中止液前，样品允许在４℃保存过夜)，在台式离心机中离心，以中止反应。样品于－２０℃保存。
DNA序列的正确测定，是进行基因结构和功能分析，绘制基因图谱、转基因检测等方面工作的重要前提。同时DNA测序技术为快速、简捷分析蛋白序列及结构提供了工具。
DNA序列测定技术是在DNA内切酶、合成酶的应用，基因克隆及亚克隆技术，高分辨率聚丙烯酰胺变性胶电泳技术等基础上建立起来的。这些技术主要有三部分组成，首先为通过各种酶的应用和克隆技术获得一组有相同起点端而终止端在长度上相差一个核苷酸的DNA片段群。其次为通过聚丙烯酰胺凝胶变性电泳，将以上在长度上差一个核苷酸的DNA片段群相互分开。最后是通过放射自显影或化学方法将经变性电泳分开的DNA片段显色。
目前研究人员获得一端相同、另一端差一个核苷酸的途径，主要是采用Sanger(1977)的酶促合成法或Maxam和Gilbert(1977)的化学降解法。在酶促合成法中，人们将待测序列的DNA片段作为模板，以与模板3'端相配对的寡聚核苷酸作为引物，利用Klenow片段、测序酶、Taq酶及AmpliTaq酶等DNA合成酶扩增与模板配对的DNA片段，在扩增过程中，同时进行四组平行实验，每一组中含四种dNTP,和一种ddNTP，这样经过一段时间的扩增，即可获取分别以Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ为结尾的四组由所有可能长度核苷酸片段组成的DNA片段群。在化学降解法中，人们用专一性作用于A,T,G,C碱基的化学药剂分别处理经内切酶切割而成的一定长度DNA片段，通过控制反应时间，既可获得分别以A、T、G、C为结尾的四组由所有可能长度核苷酸片段组成的DNA片段群。在以上两种方法中，除了要研究与DNA的高级结构、DNA－蛋白质结构相关性有关的序列分析时，采用化学降解法外，对于单纯以测序为目的的实验，研究人员用得较普遍的是酶促合成法，在这种方法中，可测DNA片段长度及正确性与所选用的合成酶类型关系极大(详见附表)。在测序工作的早期阶段，人们只能对ssDNA进行测序，因此在进行测序前，必须将待测片段克隆到M13嗜菌体等中，将dsDNA变成ssDNA，并同时使模板量扩增，然后再测序。而近阶段，随着PCR技术的发展，人们可以利用耐热性Taq酶，采用不对称PCR技术，对待测片段在体外完成单链片段的富集和模板扩增，从而可直接测定dsDNA序列。在酶促合成法测序中，影响测序正确性的另一重要因素为引物的选用，实验中所使用引物一般有特异性引物和通用性引物，前者指当待测片段一端的数十个核苷酸序列已知时，即可人工合成与其相配对的一段寡聚核苷酸作为引物。后者为待测片段末端序列未知，但其末端侧翼有通用型载体片段，且此载体片段为某一内切酶的酶切片段，此时即可选用与此片段配对的商品化通用型引物；另外当待测片段侧翼无载体片段时，人们也可通过DNA联接酶和内切酶的协同使用，在其末端添加上与通用型引物配对的一段寡聚核苷酸。引物的具体要求可参考附录。模板的质量及数量也是影响测序结果的一个重要因素。
测序胶是影响测序质量(包括可读性、可读长度、可重复性等)的又一重要因素。不管是酶促合成还是化学降解得到的不同长度核苷酸片段，都必须通过测序胶来区分并显示。一般通过测序胶可读取300-400核苷酸的可靠序列，但如果在相邻样槽中进行时间梯度电泳，即可最多读取500以上核苷酸的序列。测序胶的一些参数影响着测序结果，具体为：
１：胶浓度
高浓度(12-20%)的胶适合读取引物5'端50个核苷酸以内的序列。
低浓度(６％及以下)的胶可读取5'端400以内或更远的核苷酸序列。
２：胶长度 40-50cm
３：胶厚度 0.4mm。小于此，胶上条带分辨效果好，但极难操作，极易破裂；大于此，条带分辨率下降，且胶难固定和干燥。另外，如采用上薄下厚的胶可改善条带上紧下疏的现象。
４：缓冲液 如配胶缓冲液采用梯度性，也可改善条带上紧下疏的现象。
５：胶板温度：要求整个胶板温度均一，保持在50℃上下，以防止DNA形成链间配对，
经胶分离后条带的显色，主要有同位素标记和非放标记两种。从该技术诞生到现在，基本上都采用对核苷酸进行同位素标记，然后放射自显影，不过，现在在标记物选用上多用35S替代32P。考虑到同位素标记的传统测序使用限制了许多研究人员的工作。目前国外一些公司开发出了一些非同位素测序方法。如银染测序法或地高辛标记探针测序法等。本实验即采用银染法进行DNA序列测定。以使学员对测序技术有一初步了解。PCR测序优点在于１)选用耐热性和热稳定性好的Taq酶，采用不对称PCR直接对dsDNA片段测序。在PCR过程中采用较高的复性温度，增加了引物与模板的特异性结合；较高的延伸温度，防止了DNA二结结构的形成。这些保证了结果的正确性和可重复性。2)需用模板量少，ng-μg级即可。以PCR反应为基础的龈染测序有PCR测序的优点，有不用同位素标记的长项，但也有无法克服的缺陷1)模板及引物纯度要求极高，PCR反应的参数要求较严；2)电泳后步骤要求比较严，略有差错，实验将全盘失败;3)，实验对化学试剂及水的质量要求极高，实验结果与操作经验的相关性极大。
一：仪器:
离心机,PCR仪,高压电泳仪, 测序槽 ,摇床 ,染色,脱色缸
二：试剂：
测序反应试剂 ,硝酸银,硫代硫酸钠,碳酸钠,37％甲醛,冰乙酸，乙醇,硅化及反硅化试剂
固定/终止液：１０%冰乙酸
染色液：混合２g硝酸银，3ml 37%的甲醛于２l超纯水中
显影液：在２l超纯水中溶解60g碳酸钠，冷却至10-12℃，临用前再加入3ml 37%甲醛，400μl 硫代硫酸钠(10mg/ml)。现配现用。
三：操作
（一）：测序反应操作
1：标记4个0,5ml的微量离心管(G.A.T.C)，每管加入２μl相应的d/ddNTP混合物，盖上盖子，保存于４℃或冰浴备用。
2：另外准备离心管按下表分别加入各种试液
任意模板平端 克窿到PGEM载体多克窿位点区的DNA
５×测序缓冲液 ５μl ５×测序缓冲液 ５μl
模板DNA fmol-pmol PGEMDNA(4μg) 4μl
特异性引物(4.5pmol) 3.6ul pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6μl
加水到终体积 １６μl 加水到终体积 １６μl
３：在上述２的模板/引物混合物中加入1μl测序级Taq酶(5μ/μl)，用移液器抽吸几次混匀。
４：从上述３中吸取４μl分别加入１中准备好的四组d/ddNTP混合液的离心管中。
５：在台式离心机中离心，使各试剂混合并沉降于管底。
６：在每管中加入一滴矿物油。
７：PCR反应，具体参数如下
95℃预变性 ２min 95℃(变性) 45秒 42℃(退火) 45秒 70℃(延伸) 60秒 60循环 70℃(延伸) 10min（注意：反应参数随PCR仪不同、引物不同有较大变化）
８：PCR结束后，在每管中加入3μl DNA测序中止液(在加入中止液前，样品允许在４℃保存过夜)，在台式离心机中离心，以中止反应。样品于－２０℃保存。
(二)：测序胶的制备
１：玻璃板的处理
Ａ，长板（不带凹槽、反硅化处理，粘胶板）
a,２N NaOH浸泡１小时以上，自来水冲洗，海绵或软布蘸洗涤剂将板清洗干净，自来水冲洗掉全部洗涤剂，无离子水中过三遍，晾干。b, 在1ml95%乙醇，0.5%冰乙酸中加入5μl粘合硅烷。c, 用b中所配溶液浸透薄棉纸，用此薄棉纸均匀擦拭玻璃板d，晾干后，用95%乙醇单向擦拭该板，然后略微用力沿垂直方向擦拭该板。重复３此这一乙醇擦拭过程。
Ｂ：短板（带凹槽、硅化处理，不粘胶板）
a,海绵或软布蘸洗涤剂将板清洗干净，自来水冲洗掉全部洗涤剂，无离子水中过三遍，晾干。b，用硅化液浸透的薄棉纸均匀擦拭该板。c，晾干后，用薄棉纸擦掉多余的硅化液。
２，按图将两块玻璃板及夹条安装好。
３，制胶 ６％的变性胶
Acr/Bis 19:1 ,
尿素 8M
Tris 90mM
硼酸 90mM
EDTA 2mM
TEMED(%) 0.05
抽气 ４℃保存
临用前按400μl/75ml预混液的比例加入过硫酸氨(100mg/ml)
４：灌胶
（三）：电泳
１，胶凝后，插入鲨鱼齿,
２，将Ⅰ中制备好的样品在90℃加热２分钟
３，加样，电泳，维持2000伏以上恒压（在加样前，同样电压预电泳），直至指示剂跑到胶下沿。
电极缓冲液为1×TBE。
（四）：银染
１，电泳结束后，橇开板，将附着胶的一块板置于固定/终止液中浸泡过夜或震荡3０分钟，直至指示染料消失。
２，凝胶洗涤，用超纯水震荡洗涤胶３次，每次２分钟，凝胶板从水中取出后，竖起控水１０－２０秒。
３，染色，将胶板移至染色液中，摇床震荡３０分钟。
４，凝胶洗涤，将染色后的胶板，放入超纯水中２－３秒后，迅速取出并竖起控水，随后把胶板放入预冷的显影液中（用量为总量的1/2），充分震荡，当第一批条带后，把胶板移入预冷的另一半显影液中，震荡，直至全部条带出现。
注意：从放入水到放入显影液中，之间时间不超过５－１０秒。
５，终止显影，在显影液中直接加入等体积的固定/终止溶液（第一步操作时用过的），停止显影反应并固定影象。
６，洗涤凝胶，在超纯水中洗涤凝胶２次，每次２分钟。
７，胶板干燥，将显影后的胶板置于室温下，自然干燥。
８，干燥后的胶片可以永久保存，或进行拍照或进行EDF胶片拷贝。
（五）EDF胶片拷贝
EDF胶片拷贝能增强条带的显色强度
1:在暗室中将干燥后的胶板置于光源上(胶面向上)
2:裁一条EDF胶片,进行曝光时间的确定
3:在红灯下,找到EDF胶片上有缺刻的一角,然后把EDF放于胶上,有缺刻的位置为左上角.在EDF上再放一干净的玻璃板。
4:根据以确定的曝光时间,对EDF曝光。
5:显影 在Kodax GBX显影液中显影1-5分钟
6:水洗1分钟
7:在Kodax GBX中定影3分钟
8:水洗1分钟.
9:烤干。
注意:
1： 鲨鱼齿插入深度不能过深,否则可上样量少,也不能过浅,否则易造成点样槽渗漏,一般插入深度以0.5毫米为好。2：一定要进行预电泳,其作用为提高胶的温度,防止DNA单链间的胶连3：上样前应用1毫升枪吸打上样孔,吸取样品应尽量不把上层矿物油带入,加样动作要快,以防止扩散。4：本实验所有部分尤其是（三），（四）、（五）三部分操作中一定要戴手套。
附录1：未知模板的用量
[200bp(PCR产物) 16ng]
[3000-5000bp（超螺旋质粒DNA4μg]
[48000bp(λ或粘粒DNA 1μg]
2：测序反应中所用聚合酶的特性
酶 持续合成能力bp 聚合速率bp/秒
Klenow片段 15-20 45
AMV 未测 5
测序酶 2000 300
Taq酶 <7600 35-100
3：引物设计要求
1):碱基组成应匀称，G+C含量为40-55%，长度为１８聚。如G+C含量在此值外，则长度应为18+n/2,对于AT丰富区，n=50-(G+C)%；对于GC丰富区，n=(G+C)%-50。2)，引物中不应含二重对称区，以防止形成发夹或颈环结构。3):引物纯度至少要到电泳级
4:各种溶液组成
5:ddNTP与dNTP的组成比例
