一、目的
学习和掌握测定DNA的定糖法（二苯胺法）的原理和操作技术。
二、原理
脱氧核糖核酸中的α—脱氧核糖在酸性环境中变成ω—羟基—γ酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收，在每毫升含DNA20~400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖也有同样的反应。
三、材料、试剂和器具
（一）试剂
1、DNA标准溶液：取小牛胸腺DNA用0.1N氢氧化钠溶液配制成200微克/毫升的溶液。
2、DNA样品液：（自己提取）控制其DNA含量在50~100微克/毫升左右。
3、二苯胺试剂：称取1克结果的二苯胺试剂溶于100毫升分析纯的冰醋酸中，再加入10毫升过氯酸（A.R60%以上）或浓硫酸2.75毫升，混匀备用。临用前加入1毫升1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液应为无色。
（二）器具
1、试管及试管架
2、移液管（1，2，5毫升）
3、恒温水浴
4、可见光分光光度计
四、操作步骤
（一）DNA标准曲线的制作
取8支试管，编号，按下表加入试剂
管号
试剂
0
1
2
3
4
5
6
7
DNA标准液
0
0.2
0.4
0.8
1.0
1.2
1.6
2.0
蒸馏水
2
1..8
1.6
1.2
1.0
0.8
0.4
0
二苯胺试剂
4
4
4
4
4
4
4
4
加毕，摇匀，于60℃恒温水浴中保温1小时，（或于沸水中煮沸15分钟，冷却测0.D595nm值。）以光密度为纵坐标，DNA含量（ug/ml）为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定
取2支试管，各加0.2~0.5毫升的待测液（内含DNA应在标准曲线可测范围之内）加蒸馏水稀释至2毫升，再加4毫升二苯胺试剂，摇匀，其操作步骤与标准曲线的制作相同。根据测得的光密度值，从标准曲线上查出相当该光密度DNA的含量，按下式计算出样品中DNA的百分含量。
DNA含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数
五、注意事项
1、二茉胺法测定DNA含量灵敏度不高，待测样品中DNA含量低于50mg/L即难以测定。乙醛可增加二苯胺法测定DNA的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，能显著提高测定的灵敏度。
2、样品中含有少量RNA并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯胺反应形成有色化合物，故能干扰DNA定理。
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