【原理】
PCR 即聚合链式反应，它是近年来发展起来的一种体外扩增特异性 DNA 扩增技术。 PCR 技术实际上是在模板 DNA 、引物和４种脱氧核糖核苷酸 (dNTP) 存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促合成反应。 PCR 技术的特异性取决于引物和模板 DNA 结合的特异性。反应分 3 步： ① 变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链 DNA ； ② 退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物 DNA 量大大多于模板 DNA ，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板 DNA 双链之间互补的机会较少。 ③ 延伸：在 DNA 聚合酶和 4 种 dNTP 底物及 Mg 2+ 存在的条件下， 5'→3' 的聚合酶催化以引物为起始点的 DNA 链延伸反应，以上 3 步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性 DNA 片段得到了大量复制，数量可达 2×10 6 ～ 7 拷贝。
绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光， GFP cDNA 开放阅读框架长度约 714bp ，编码 238 个氨基酸残基，其肽链内部第 65-67 位丝氨酸－脱氢酪氨酸－甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。 绿色荧光蛋白是常用的报考基因之一。 转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪 (FACS) 中直接观察基因的表达。 本实验利用含绿色荧光蛋白基因的质粒为扩增模板，加入绿色荧光蛋白基因 cDNA 的上游和下游引物和 4 种 dNTP 底物，在 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 扩增。理论上扩增的 PCR 产物大小为 720kb 。
【试剂与器材】
1 ．上游引物 : 5′- TT GGTACC ATGGCTAGCAAAGGAGAAG -3′ ，其序列含绿色荧光蛋白基因 cDNA 编码区起始的 19 个核苷酸，其 5' 端含 KpnI 酶切位点。浓度为 5 pmol/μl 即 5 μmol/L ， 50μl 反应液中加 25pmol 。
2 ．下游引物 : 5′- TA GGGCCC TTATTTGTAGAGCTCATCC -3′ ，与绿色荧光蛋白基因 cDNA 编码区最后 21 个核苷酸互补，其 5' 端含 ApaI 酶切位点。浓度为 5 pmol/μl 即 5 μmol/L ， 50μl 反应液中加 25pmol 。绿色荧光蛋白基因
3 ． DNA 模板：绿色荧光蛋白基因 cDNA 质粒 (pLSNX ， 6.4kb) ，浓度为 2ng/μl ， 50μl 反应液中加 10ng 。
4 ． 10×buffer 浓度（购买 Taq 酶有配套的 Buffer ） :
500mmol/L KCl ， 100mmol/L Tris-Cl ， pH9.0 ， 1% Triton-X 100
5 ． 10×MgCl 2 即 25mmol/L 。
6 ． dNTP 2.5mmol/L 分别取等体积的 10mol/L 的 dATP ， dGTP ， dTTP ， dCTP 四种混合即成
7 ． Taq DNA 聚合酶（国产或进口）：浓度为 5 U/μl ， 50μl 反应液中加 1U 。
8 ．消毒三蒸水。
9 ． 6× 载样 buffer 0.25% 二甲苯青 FF ， 0.25% 溴酚蓝， 30% 甘油
10 ． 50×TAE 电泳 Buffer 12.2g Tris ， 2.85ml 冰醋酸， 10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0) ，加水至 50ml 。
11 ．溴化乙锭 (EB) 溶液 10mg/ml( 避光保存 ) ，每 100ml 琼脂糖凝胶加 5μl 贮存液，即凝胶中 EB 终浓度为 0.5μg/ml ，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，避免污染环境。
12. DNA Marker 。
13 ．各种国产或进口移液器 (10 ， 20 ， 100μl)
14 ．消毒的 0.2ml PCR 管， 10μl ， 100μl tips
15 ．小型离心机
16 ． PCR 仪
17 ．水平电泳槽和电泳仪
18 ．紫外分析仪
【原理】
PCR 即聚合链式反应，它是近年来发展起来的一种体外扩增特异性 DNA 扩增技术。 PCR 技术实际上是在模板 DNA 、引物和４种脱氧核糖核苷酸 (dNTP) 存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促合成反应。 PCR 技术的特异性取决于引物和模板 DNA 结合的特异性。反应分 3 步： ① 变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链 DNA ； ② 退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物 DNA 量大大多于模板 DNA ，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板 DNA 双链之间互补的机会较少。 ③ 延伸：在 DNA 聚合酶和 4 种 dNTP 底物及 Mg 2+ 存在的条件下， 5'→3' 的聚合酶催化以引物为起始点的 DNA 链延伸反应，以上 3 步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性 DNA 片段得到了大量复制，数量可达 2×10 6 ～ 7 拷贝。
绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光， GFP cDNA 开放阅读框架长度约 714bp ，编码 238 个氨基酸残基，其肽链内部第 65-67 位丝氨酸－脱氢酪氨酸－甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。 绿色荧光蛋白是常用的报考基因之一。 转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪 (FACS) 中直接观察基因的表达。 本实验利用含绿色荧光蛋白基因的质粒为扩增模板，加入绿色荧光蛋白基因 cDNA 的上游和下游引物和 4 种 dNTP 底物，在 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 扩增。理论上扩增的 PCR 产物大小为 720kb 。
【试剂与器材】
1 ．上游引物 : 5′- TT GGTACC ATGGCTAGCAAAGGAGAAG -3′ ，其序列含绿色荧光蛋白基因 cDNA 编码区起始的 19 个核苷酸，其 5' 端含 KpnI 酶切位点。浓度为 5 pmol/μl 即 5 μmol/L ， 50μl 反应液中加 25pmol 。
2 ．下游引物 : 5′- TA GGGCCC TTATTTGTAGAGCTCATCC -3′ ，与绿色荧光蛋白基因 cDNA 编码区最后 21 个核苷酸互补，其 5' 端含 ApaI 酶切位点。浓度为 5 pmol/μl 即 5 μmol/L ， 50μl 反应液中加 25pmol 。绿色荧光蛋白基因
3 ． DNA 模板：绿色荧光蛋白基因 cDNA 质粒 (pLSNX ， 6.4kb) ，浓度为 2ng/μl ， 50μl 反应液中加 10ng 。
4 ． 10×buffer 浓度（购买 Taq 酶有配套的 Buffer ） :
500mmol/L KCl ， 100mmol/L Tris-Cl ， pH9.0 ， 1% Triton-X 100
5 ． 10×MgCl 2 即 25mmol/L 。
6 ． dNTP 2.5mmol/L 分别取等体积的 10mol/L 的 dATP ， dGTP ， dTTP ， dCTP 四种混合即成
7 ． Taq DNA 聚合酶（国产或进口）：浓度为 5 U/μl ， 50μl 反应液中加 1U 。
8 ．消毒三蒸水。
9 ． 6× 载样 buffer 0.25% 二甲苯青 FF ， 0.25% 溴酚蓝， 30% 甘油
10 ． 50×TAE 电泳 Buffer 12.2g Tris ， 2.85ml 冰醋酸， 10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0) ，加水至 50ml 。
11 ．溴化乙锭 (EB) 溶液 10mg/ml( 避光保存 ) ，每 100ml 琼脂糖凝胶加 5μl 贮存液，即凝胶中 EB 终浓度为 0.5μg/ml ，此试剂为强致癌物，要戴手套操作，避免污染环境。
12. DNA Marker 。
13 ．各种国产或进口移液器 (10 ， 20 ， 100μl)
14 ．消毒的 0.2ml PCR 管， 10μl ， 100μl tips
15 ．小型离心机
16 ． PCR 仪
17 ．水平电泳槽和电泳仪
18 ．紫外分析仪
【操作步骤】
1.PCR
取 0.2mlPCR 管，按下表操作：
试剂
加入量 2
最终浓度 ( 或含量 )
DNA 模板 (pLSNX)
5μl(2ng/μl)
10ng
10×buffer
5μl
1×buffer
10×MgCl
5μl
2.5mmol/L
dNTP
4μl
上游引物
5μl （ 5μmol/L ）
25pmol
下游引物
5μl （ 5μmol/L ）
25pmol
Taq DNA 聚合酶
0.2μl (5 U/μl)
1U
消毒三蒸水
21μl
总体积
50μl
用手指弹管壁混匀，稍离心，盖盖，编号。于 PCR 仪上进行 PCR 反应。 PCR 反应参数为 : 热启动 94℃ ， 3min;94℃,30s,50℃,30s,72℃,50s,30 个循环； 72℃,3min 。反应完成后，取 5μL 样品在 0.8% 的琼脂糖凝胶电泳。
2．琼脂糖凝胶电泳
（1）制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量，见表。
表 琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA大小范围的关系
凝胶中的琼脂糖含量[%(w/v)] 线性DNA分子的有效分离范围(kb)
0.3 5～60
0.6 1～20
0.7 0.8～10
0.9 0.5～7
1.2 0.4～6
1.5 0.2～3
2.0 0.1～2
称取 0.8g 琼脂糖倒入三角瓶中，加入 1×TAE 缓冲液 100ml ，置微波炉或水浴加热至完全熔化，取出摇匀，稍冷却后加 50μl EB 染色液，摇匀。
（ 2 ）灌胶
a. 取洁净的电泳内槽 ( 又称托盘 ) ，用橡皮膏或透明胶带将内槽的两端边缘封好 ( 一定要封严，不能留缝隙 ) 。
b. 将内槽放置于一水平台面，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。
c. 将冷却至 60℃ 左右的琼脂糖凝胶液，缓慢倒入内槽，直至所需厚度，注意不要形成气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破。
d. 待胶凝固后，小心取出梳子，撕去橡皮膏或透明胶带，将带凝胶的内槽放入电泳槽中，注意凝胶点样端要靠近负极。
f. 加入 1×TAE 缓冲液至电泳槽，缓冲液刚没过凝胶表面即可。
3 ．加样 剪取适当大小的蜡膜 (Parafilm 膜 ) ，取 6× 上样缓冲液 1μl 点于膜上数点。取 5μl 样品 ,DNA 分子量标准分别与上样缓冲液混匀。将其分别加入凝胶的点样孔 ( 记录点样顺序及点样量 ) 。
4 ．电泳 接通电源槽与电泳仪的电源 ( 检查正负极， DNA 片段是从负极向正极移动 ) 。 DNA 的迁移率与电压成正比，电压不超过 5V/cm 凝胶长度。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿 1 ～ 2cm 处，切断电源，停止电泳。
5 ．观察结果 取出内槽，在紫外分析仪的玻璃平板上小心推出凝胶，通过防护屏或戴防护眼镜观察紫外灯透射的结果， DNA 存在处应显出桔红色荧光条带，观察 DNA 带的泳动位置。
6 ．摄影 在镜头前加一块红色滤光片，使用 100o 黑白胶卷，利用透射紫外光作光源，光圈 2.8 ，曝光 0.5 ～ 2s ，调准焦距，可拍摄质量较好的凝胶照片。有条件则使用 DNA 一次成像仪。
7 ．切胶回收：
在紫外分析仪上将 0.73 kb 片段用手术刀切下。
产物加入等体积的酚 / 氯仿，颠倒混匀后 10000×g ，离心 15min ，吸取水相，水相中加入 1/9 体积的 3mol/L 乙酸钠（ pH5.2 ），混匀后加入两倍体积的冰乙醇， -20℃ 静置 30min 。 12000×g ，离心 15min 后用 70% 的乙醇漂洗除盐，沉淀用 50μl 的 TE （ pH 8.0 ）溶解， -20℃ 冻存。
