一、原理
大肠杆菌可以利用噬菌体为媒介，将供体细胞DNA转移给受体细胞，从而使受体细胞的基因型和表现型发生改变，这一过程称为转导。由类似噬菌体P1和P2介导的转导，能够转移供体染色体上任何一个基因，称为普遍性转导；由λ噬菌体等为媒介的转导，只能转导半乳糖发酵基因等少数基因，称为局限性转导。
P1噬菌体的DNA分子量为5.8×107D，大约相当于大肠杆菌染色体的2％。在转导过程中，它的外壳中几乎只包装着寄主菌的染色体片断。假如大肠杆菌染色体的全长是100分钟，则P噬菌体外壳中包装的DNA片段最多可以带有相隔两分钟范围内的寄主基因。可以想象，包装时寄主染色体的断裂是随机的，两个基因相隔愈近，共转导的机率愈高。如果两个基因密切连锁，共转导的频率将接近1；相距很远，其共转导频率就接近或等于0。共转导频率（X）＝(1-d/L)3,d为以分钟计算的转导DNA的长度。利用这种关系可以进行两个距离很近的基因的定位，也可用来进行基因精细结构分析。位置非常接近的一系列拟等位突变位点也可以通过其转导测得它们的排列顺序。
由于转导的频率一般很低，大约每个感染细胞只有10-4－10-5。因此常用的方法是选取某一选择性标记的转导子，然后测定另一基因的出现频率，根据公式计算，确定它们之间的连锁关系。
二、目的
了解大肠杆菌普遍性转导的现象、原理和普遍性转导在细菌基因精确定位中的作用，掌握普遍性转导和基因定位的基本方法。
三、材料
1、受体菌：CSH1F- trp lacZ thi strA
2、供体菌：FD1009Hfr sup tsx。
3、噬菌体P1 cml, clr1000裂解液(109ml)
4、噬菌体T6裂解液
5、生理盐水稀释管(4.5ml／支)
6、0.1mol/L CaCl2
7、LB液体(5ml/支)、半固体(3ml/支)和固体培养基
8、氯仿
9、乳糖色氨酸基本培养基、葡萄糖基本培养基、葡萄糖色氨酸基本培养基
10、培养皿、三角瓶、试管、离心机、灭菌牙签、吸管、接种环、酒精灯。
四、实验步骤
（一）Pl cml, clr100裂解液的制备
1、第一天，接种供体菌株于LB液体培养基中，30℃培养过夜。
2、第二天，将供体菌液用LB培养液按1：5稀释，30℃继续培养2小时。然后吸取0.2ml供体菌和0.1ml、10-2的噬菌体原液（滴定度为109/ml左右，细菌和噬菌体数目比大约为20：1）与3ml半固体LB培养基混匀后，倒在LB固体培养基上，凝固后37℃培养过夜。每组做3－4皿。其中有一皿不加噬菌体作为对照。
一、原理
大肠杆菌可以利用噬菌体为媒介，将供体细胞DNA转移给受体细胞，从而使受体细胞的基因型和表现型发生改变，这一过程称为转导。由类似噬菌体P1和P2介导的转导，能够转移供体染色体上任何一个基因，称为普遍性转导；由λ噬菌体等为媒介的转导，只能转导半乳糖发酵基因等少数基因，称为局限性转导。
P1噬菌体的DNA分子量为5.8×107D，大约相当于大肠杆菌染色体的2％。在转导过程中，它的外壳中几乎只包装着寄主菌的染色体片断。假如大肠杆菌染色体的全长是100分钟，则P噬菌体外壳中包装的DNA片段最多可以带有相隔两分钟范围内的寄主基因。可以想象，包装时寄主染色体的断裂是随机的，两个基因相隔愈近，共转导的机率愈高。如果两个基因密切连锁，共转导的频率将接近1；相距很远，其共转导频率就接近或等于0。共转导频率（X）＝(1-d/L)3,d为以分钟计算的转导DNA的长度。利用这种关系可以进行两个距离很近的基因的定位，也可用来进行基因精细结构分析。位置非常接近的一系列拟等位突变位点也可以通过其转导测得它们的排列顺序。
由于转导的频率一般很低，大约每个感染细胞只有10-4－10-5。因此常用的方法是选取某一选择性标记的转导子，然后测定另一基因的出现频率，根据公式计算，确定它们之间的连锁关系。
二、目的
了解大肠杆菌普遍性转导的现象、原理和普遍性转导在细菌基因精确定位中的作用，掌握普遍性转导和基因定位的基本方法。
三、材料
1、受体菌：CSH1F- trp lacZ thi strA
2、供体菌：FD1009Hfr sup tsx。
3、噬菌体P1 cml, clr1000裂解液(109ml)
4、噬菌体T6裂解液
5、生理盐水稀释管(4.5ml／支)
6、0.1mol/L CaCl2
7、LB液体(5ml/支)、半固体(3ml/支)和固体培养基
8、氯仿
9、乳糖色氨酸基本培养基、葡萄糖基本培养基、葡萄糖色氨酸基本培养基
10、培养皿、三角瓶、试管、离心机、灭菌牙签、吸管、接种环、酒精灯。
四、实验步骤
（一）Pl cml, clr100裂解液的制备
1、第一天，接种供体菌株于LB液体培养基中，30℃培养过夜。
2、第二天，将供体菌液用LB培养液按1：5稀释，30℃继续培养2小时。然后吸取0.2ml供体菌和0.1ml、10-2的噬菌体原液（滴定度为109/ml左右，细菌和噬菌体数目比大约为20：1）与3ml半固体LB培养基混匀后，倒在LB固体培养基上，凝固后37℃培养过夜。每组做3－4皿。其中有一皿不加噬菌体作为对照。
3、第三天，当噬菌体充分增殖后，将平板表面的半固体培养基转移到无菌的三角瓶中，加入5－10ml LB液体培养基和几滴氯仿，剧烈振荡20秒后离心(3000rpm, 10分钟)，上清液即为P1 cml, clr100裂解液。
4、将上清液移到无菌试管中，加入几滴氯仿，再次剧烈振荡20秒，于4℃保存。
(二)P1 cml，clr100裂解液效价测定
1、第三天，将30℃培养过夜的供体菌用10ml LB培养液按1：5稀释，30℃继续培养3小时。
2、分别吸取0.2ml新鲜培养物加入10支干净无菌的试管中，编号。
3、将待测噬菌体裂解液用LB培养液按1：10进行梯度稀释。
4、从每个稀释液中吸取20ul分别加入含供体菌的试管中，混匀。
5、于每支试管中加入3ml预平衡在50℃的LB半固体培养基，迅速摇匀后倒在LB固体培养基上，固化后37℃培养过夜。每组十一皿，其中一皿不加噬菌体作为对照。
6、第四天，统计不同浓度噬菌体裂解液的噬菌斑数，记录结果。计算P1噬菌体的效价，即每毫升噬菌体原液中P1噬菌体的数目（表3－1）。
（三）转导
1、第三天傍晚，接种受体菌株（CSH1）于5ml LB液体培养基中，30℃培养过夜。
2、第四天，将过夜培养的受体菌用LB培养液按1：5稀释，37℃培养2－3小时。
3、在培养液中加无菌的CaCl2溶液（终浓度为5×10-3mol/L）。
4、取滴定度约为1010/ml左右的噬菌体裂解液，稀释100、10-1、10-2、10-3倍。
5、取噬菌体稀释液与受体菌各1ml，加入一干净无菌的试管中混合。作为对照，其中一组应只加裂解液不加受体菌。
6、37℃保温20分钟，取出后离心15分钟，3500rpm。弃去上清液，加入1ml无菌生理盐水重悬菌体。
7、取100ul转导液涂布于乳糖色氨酸基本培养基（2皿）和葡萄糖基本培养基（1皿），37℃培养。以未经噬菌体处理的受体菌作对照，各涂1皿。同时将对照菌作梯度稀释，取10-5及10-6的稀释液分别涂布在色氨酸葡萄糖基本培养基上进行活菌计数。
8、第六天，观察统计菌落生长情况，计算转导频率（表3－2）。
（四）共转导测定
1、第六天，取0.1ml滴定度为109－1010pfu的T6噬菌体裂解液涂布在LB完全固体培养上（2皿），室温下待裂解液吸干。
2、用灭菌牙签挑取100－200个在乳糖色氨酸基本培养基上长出的单菌落，点种在上述涂布T6噬菌体的培养基上，37℃培养。
3、第七天，计数长出的菌落（表3－3），计算共转导率。
五、实验结果
1、P1噬菌体的效价测定
表3－1 不同稀释平板上出现的噬菌斑数
裂解液稀释度
100
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
对照
第一组
第二组
…
平均数
噬菌斑数/ml
2、色氨酸和乳糖发酵基因的转导频率
表3-2 不同培养基上转导子数量统计
培养基类型
转导标记
转导子
数目/板
转导子
数目/ml
受体菌
数目/ml
转导频率*
[-]加葡萄糖
Trp
[-]加乳糖+trp
乳糖
[-]加葡萄糖+trp
活菌计数
3、计算乳糖发酵基因和T6抗性基因的共转导频率，并计算乳糖发酵基因和T6抗性基因的图距。
表3－3 共转导选择测定结果
组别
点种菌落数
(a)
[+]+T6培养皿上
长出的菌落数(b)
共转导频率*
(X)
一
二
三
平均数
*共转导频率X=(b"pide;a)×100%
d=L(1-X1/3)
