Regulus Therapeutics、Mirna Therapeutics、miRagen Therapeutics三家生物技术公司携手制药界土豪Sanofi、AstraZeneca、Servier引领全球microRNA药物研发，目前已有miR-122、miR-34两个靶点进入临床研究阶段，病毒感染、癌症、心脏病、糖尿病等多个适应症在研。
关于microRNA的基础知识不再赘述，参考本科分子生物学教材。
1. 抑制miRNA的方法
(1) miRNA诱骗剂
miRNA诱骗剂（miRNA sponge）是使用一段人造的含多个miRNA结合点的mRNA，诱骗miRNA与之结合从而表达目标mRNA。这种方法在研究miRNA功能的体外实验中有广泛应用，但在体内的应用极其有限，主要通过转基因动物在靶组织中过度表达miRNA诱骗剂。
(2) 反义核酸
针对RNA靶点最常用的手段就是反义核酸，反义核酸通过与miRNA高度互补，可以组断miRNA与目标mRNA结合。反义核酸是很难直接用于体内的，它们很难直接穿透细胞膜，需要经过化学修饰改善PD/PK。
(3) 小分子抑制剂
miRNA涉及多个生物化学步骤，可以筛选小分子抑制剂，干扰miRNA的表达和功能的实现。比如有文献[1,2]报道了抑制miR-21和miR-122的小分子，但EC50在微摩尔级，而且缺乏直接靶点的信息，因此应用潜力仍然非常有限。
2. 反义核酸的化学修饰
(1) 2ʹ- O-甲基化
将核苷酸2’-位的羟基甲基化是一种常见方法，可以提高寡核酸对核酸酶的耐受性。2004年的两篇篇论文中[3,4]，作者分别用一段31个核苷酸、24个核苷酸长度的甲基化RNA抑制miRNA和siRNA的功能。尽管甲基化修饰提高了寡核酸的稳定性，但仍然不能避免被血清中的核酸外切酶降解，因此不适用于体内。
(2) 硫代磷酸
由于核酸外切酶切割的是两个核苷酸之间的磷酯键，因此将磷酸基团上的一个氧原子替换为硫便能提高稳定性。硫代磷酸修饰的寡核酸增强了与血浆蛋白、细胞表面的亲和力，能够在1-2个小时内从注射部位吸收进入血液，而且能够被肝、肾、脾、淋巴结、脂肪组织、骨髓摄取。但这种修饰会降低对miRNA的亲和力，全硫代磷酸修饰的反义核酸完全没有miRNA抑制活性，因此只能选择性替换部分磷酯键。
(3) 2ʹ- O-MOE修饰
2’-位甲氧基乙基化在对miRNA的亲和力和对核酸酶的耐受性上都优于2’-位甲基化，2008年的一篇论文中[5]，作者用2ʹ- O-MOE修饰的寡核酸抑制了miR-143，从而增加了目标基因的表达，这证明了2ʹ- O-MOE修饰相对于2ʹ- O-甲基化的优势。
(4) 2ʹ-F修饰
将核苷酸2’-位的羟基替换为氟，可以将糖环锁定为3ʹ-endo构象，产生优越的亲和力，每个核苷酸片段大约增加Tm值2-3 oC。但单纯的2ʹ-F修饰是不耐受核酸酶的，必须用硫代磷酸连接才能在血清中实现较好的稳定性。
(5) 锁核酸
锁核酸是将2’-位的氧与4’-位的碳通过亚甲基连接起来，形成双环核苷酸，同时将糖环锁定为3ʹ-endo构象。这种修饰既能增加对核酸酶的耐受性，又能大幅增加对miRNA的亲和力，每个锁核酸片段大约增加Tm值4-6 oC。锁核酸性能优越，5 nM剂量下即可抑制miRNA，联合其他方法如2ʹ-F修饰，有效性可进一步增强。
3. 体内给药策略
(1) 缀合物
虽然化学修饰一定程度上改善了反义核酸的亲和力和稳定性，但缺乏载体的情况下组织分布有限，容易被肝肾摄取，很快经尿液排出体外。体内给药的一种策略是缀合物修饰，比如在3’-端接上胆固醇，这样就能混进高密度脂蛋白中，输送到肝、肾、肠及类固醇器官。
另一种方法是在5’-端接上维生素E，这可以有效地将siRNA输送到肝脏[6]，从而敲除ApoB的表达，小鼠只需要给药2 mg/kg，而如果缀合胆固醇，需要的剂量高达50 mg/kg。最近文献报道siRNA缀合SPACE肽[8]，有助于穿透角质层，因此通过皮肤给药也有可能。
TLR9 (Toll-like receptor 9)是CpG DNA的内源受体，因此可以缀合CpG DNA，从而靶向表达TLR9的细胞，这被用于沉默TLR9+骨髓细胞、B细胞中的转录因子STAT3[7]，从而增强抗肿瘤免疫应答。
(2) 脂质体
2005年Morrissey报道了应用脂质体输送siRNA的方法[9]，将siRNA用PEG脂质体包裹起来，用于阻断小鼠体内HBV的复制，剂量为3 mg/kg，远远低于裸露的siRNA，随后脂质体在核酸的给药中得到广泛研究。
特别值得一提的是GalNAc-PEG脂质体[10]，通过N-乙酰半乳糖（GalNAc）与细胞表面的半乳糖特异性受体ASGPR结合，可以实现肝靶向，有效剂量甚至可以是0.02 mg/kg。还有一种是在脂质体中引入透明质酸和整合素抗体[11]，这样可以将siRNA靶向白细胞，沉默cyclin D1的表达。
(3) 纳米粒
10-100 nm的纳米粒能够输送小分子、siRNA、anti-miR，早期的研究采用聚乙烯亚胺纳米粒，缀合PEG和结合整合素的Arg-Gly-Asp肽，形成polyplexe输送siRNA进入肿瘤[12]。但这种纳米粒只有中等程度的抗肿瘤活性，可能是由于未经修饰的siRNA被降解了。
后来文献报道采用环糊精-PEG缀合物，铁传递蛋白作为靶向肿瘤的配体，成功将siRNA输送到表达EWS–FLI1的Ewing's肉瘤[13]。后来这一纳米粒系统还进行了I期临床试验（NCT00689065），这也是全球首个siRNA临床试验[14]，证明RNA干扰确实能敲除实体瘤患者目标基因。
Baigude设计了脂官能团化赖氨酸骨架[15]，形成纳米粒用于输送siRNA，沉默ApoB基因，这种方法后来被用于输送miR-122反义核酸[16]。
(3) 抗体制导
抗体由于高亲和力和高特异性，也被用于siRNA和anti-miR的体内输送。2005年报道的F105-P是将精蛋白与HIV-1包膜抗体融合[17]，精蛋白可以结合siRNA，用这种方法可以将siRNA靶向HIV-1包膜阳性的细胞。
后来从抗体扩展到了单链可变区片段（scFv），采用CD7特异性的scFv缀合碱性多肽[18]，输送siRNA沉默CCR5。类似的还有HBV表面抗原特异性的scFv缀合精蛋白，HER2特异性的scFv缀合精蛋白。
4. miRNA靶点
(1) miR-122与HCV感染
miR-122是2005年鉴定的肝特异性miRNA，能够调节HCV的复制，因此抑制miR-122可能治疗HCV感染。Santaris Pharma开发的miravirsen目前处于II期临床，它是基于锁核酸技术的反义药物，对miR-122亲和力较高（Tm为80 oC）。I期临床显示耐受性很好，未发现剂量限制性毒性，这有望成会成为首个针对miRNA反义核酸获批。而Regulus Therapeutics开发的RG-101则是采用缀合GalNAc的方法，目前已进入I期临床。
(2) miR-34、let-7、miR-21、miR-221与癌症
2004年人们首次将miR-34 (miR-34a, miR-34b, miR-34c)与癌症联系到一起，它能抑制一系列癌基因如CDK4/6、E2F3、Myc、HDAC1、Bcl-2、SIRT1、Wnt、MTA2，多种肿瘤miR-34下调。Mirna Therapeutics开发的MRX34是一种miR-34脂质体，补充miR-34治疗肿瘤，临床前结果显示优于索拉非尼，目前已进入I期临床。
let-7是最早发现的miRNA，调节线虫的发育过程，2004年发现let-7下调与肺癌生存期相关[19]，后来发现let-7介导了对RAS的抑制，let-7下调也会增加HMGA2的表达。Let-7可抑制多种癌细胞的生长，特别是KRAS突变的细胞，Mirna Therapeutics正在开发miR-Rxlet-7，目前处于临床前。
2006年文献报道大多数肿瘤miR-21过量[20]，miR-21能够抑制多种抑癌基因如PTEN、TPM1、PDCD4，抑制miR-21可促进肝癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤细胞死亡。另外miR-21上调还会促进心脏、肾脏纤维化，Regulus Therapeutics开发了RG-012抑制miR-21，计划2014年启动I期临床。
2008年文献报道人肝细胞癌中miR-221上调[22]，这种miRNA控制着p57、p27、Bcl-2修饰因子的表达。Regulus Therapeutics与Sanofi合作开发针对miR-221的药物，目前处于临床前研究。
(3) miR-208、miR-195与心脏病
miR-208是在心脏中高度表达的一种miRNA，敲除miR-208的小鼠发育正常，但心脏逐渐失去功能，而且负荷过大也不会出现心肌肥大。miRagen Therapeutics开发了miR-208反义核酸[21]，用于治疗高血压引起的心力衰竭，不过剂量有些偏高，达到了25-33 mg/kg，目前处于临床前。
miR-195属于miR-15家族，是心脏发育过程中的一种重要miRNA，调节心肌细胞的增殖，胚胎心脏miR-195过量会导致心室发育不良、中膈缺损。miRagen Therapeutics与Servier合作开发针对miR-195的反义核酸，用于治疗心肌梗死，目前处于临床前。
(4) miR-103、miR-107与糖尿病
2011年的一篇Nature报道了miR-103、miR-107与胰岛素敏感性的关系[22]，ob/ob小鼠和DIO小鼠的miR-103、miR-107上调，沉默miR-103、miR-107可改善葡萄糖稳态和胰岛素敏感性。Regulus Therapeutics与AstraZeneca合作开发针对这个靶点的药物，目前处于临床前研究。
5. 研发miRNA疗法的挑战
(1) 杂交相关的脱靶效应
目前miRBase中已经收录了人类的2578种miRNA，许多miRNA序列相似，比如miR-17与let-7家族。同一个miRNA家族类的成员通常很难区分，2’-O-甲基化修饰的miR-93抑制剂能够抑制其他家族成员如miR-106b [23]。
(2) 杂交无关的脱靶效应
免疫系统天生就有TLR (Toll-like receptor)，溶酶体受体TLR3、TLR7、TLR8、TLR9能够识别细菌、病毒源的RNA和DNA，核酸药物可能刺激免疫系统，产生严重的免疫毒性。尽管化学修饰可以增加寡核酸的亲和力和稳定性，但也可能带来序列无关的毒性。
(3) 怎么给药
这是困扰所有核酸类药物研发的问题，核酸本身呈酸性，在血液中极不稳定，也不太容易穿透细胞膜。怎么将药物从体外送进细胞是个难题，怎么将药物靶向到病变组织避免全身毒性也是个问题。
今年4月份，前Pfizer全球研发总裁John LaMattina与Alnylam首席执行官John Maraganore争论这个问题，AstraZeneca则是悬赏10万美元征求寡核酸如何给药的意见。如果有一天药物输送问题真的解决了，RNA会成为继小分子、蛋白质后第三大类药物吗？
[1] Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2008, 47, 7482-7484.
[2] J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 7976-7981.
[3] PLoS Biol. 2004, 2, E98. Doi: 10.1371/journal.pbio.0020098.
[4] RNA. 2004, 10, 544-550. Doi: 10.1261/rna.5235104.
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Ref: Nat Rev Drug Discov. 2014, doi: 10.1038/nrd4359.
