使用芯片技术研究通常需要使用新鲜的样本或快速冷冻的样本,但是世界上大约有数十亿份组织样品保存在医院或者组织样品库中,其中绝大多数是福尔马林固定石蜡包埋的方法处理(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded,FFPE)的样品。如何获得FFPE 样本所蕴藏的生物信息,如何利用分子生物学方法对FFPE 样本进行检测,进而针对FFPE 样本进行高通量组学分析就变得越来越重要。
一. FFPE样本准备、储存及运输
样本质量是确保下游研究应用(微阵列芯片、新一代测序,Real-Time PCR等)中获得高质量数据的关键。 FFPE 样本质量与样本固定时间,储存条件与储存年限等密切相关。注意事项如下:
样本固定 | 手术后,组织样本切成小块后,一个小时内固定。固定时间~24小时,不宜过长。 |
样本储存 | 无切面存储,避免氧气、水及其他环境因素如光侵扰(真菌、昆虫等)的影响, 4℃保存。 |
样本实验前准备 | 20 µm 4-5片,放入1.5mL离心管中,4°C保存,冷冻运输。 |
二. FFPE样本的质量控制
采用NanoDrop、Qubit® 2.0和Agilent 2100生物分析仪进行样品质检工作。
从左到右依次为NanoDrop, Qubit® 2.0, Agilent 2100生物分析仪
石蜡样本中提取的mRNA/DNA均为降解,除特殊要求外,只根据mRNA/DNA总量来判断是否可以进行后续实验。
下表就针对几种常见的微阵列芯片类型,推荐了相应的起始材料及最低需求量。
芯片类型 | 推荐芯片 | 样品类型 | 最低需求量(µg) |
表达谱芯片 | Affymetrix | Total RNA | 1 |
miRNA 芯片 | Agilent | Total RNA including miRNA | 0.5 |
aCGH芯片 | Agilent | gDNA | 5 |
三. 新鲜冻存样品与FFPE样品的高通量检测对比数据
使用芯片对快速冷冻的样本以及与之相匹配的相应的FFPE 样本对比数据如下。
——应用 Affymetrix 平台进行表达谱研究
*使用芯片: Affymetrix Human U133 Plus 2.0
*FF(新鲜冻存,fresh frozen)样品
——应用 Agilent 平台进行miRNA研究
*使用芯片:Agilent Human miRNA 芯片V16.0
*芯片质控:gNonCtrlMedPrcntCVBGSubSig *﹤15
*gNonCtrlMedPrcntCVBGSubSig:去除背景信号,非质控重复探针中位值变异系数百分比
——应用 Agilent 平台进行CNV研究
四. 新机遇
实验结果表明,在表达谱芯片的研究中,虽然FFPE样本有明显降解,但FFPE组织与新鲜冷冻组织在芯片上的平均检出率和背景都差不多;在miRNA芯片的研究中,两种样品的各项芯片质控指标相当;在CNV芯片的研究中,虽然新鲜冷冻组织的信号表达量较高,但两种样品的背景噪音值非常相近。
运用FFPE组织样品进行高通量检测,可以对存档的标本,进行常规分析,从而进行大规模回顾性研究。
如需进一步了解该技术,详见链接:https://www.ebioservice.com/show_news.asp?id=1754