E.coli感受态细胞的制备（CaCl2法）
一、准备
1．高压灭菌50毫升，15毫升离心管；180℃高温灭菌100毫升血清瓶7个，25毫升血清瓶1个，100毫升、20毫升量筒或容量瓶各1个，150毫升、50毫升烧杯各1个，摇菌用150毫升锥形瓶1个。甘油灭菌。10ml移液管3支。
2．制备灭菌水约1000毫升。
3．制备不含氨苄的LB液体培养基500ml；制备不含氨苄的LB培养基平板1-3块。
4．配置1M NaOH 以调节pH用。
5．制备针式过滤器2个，60ml、20ml 一次性注射器各一个。
6．冷冻离心机换50ml转子。
7．按下表配置TFB1、TFB2溶液。
严格按照表中顺序加溶液，配制工作液，再调pH值，过滤除菌，4℃储存。
TFB1（终体积：100ml）
MES（0.5M）: 2ml
KCl（1M）: 10ml
CaCl2·2H2O（1M）: 1ml
MnCl2·4H2O（0.5M）: 10ml
TFB2 （终体积：20ml）
MOPS（1M）： 0.2ml
CaCl2·2H2O（1M）: 1.5 ml
KCl（1M）: 10ml
甘油（50%）： 6ml
注：1、MES为：2-N-Morpholino-ethanesulfonic Acid,即2-（N-吗啡啉）乙磺酸。不易溶，配制时用NaOH调pH至6.2。
2、MOPS为：3-N-Morpholino propanesulfonic Acid,即3-（N-吗啡代）丙磺酸。
3、严格按顺序加溶液，配制TFB1工作液，用1M NaOH 调pH值至5.8，用针式过滤器过滤除菌，4℃储存。
4、严格按顺序加溶液，配制TFB2工作液，用1M NaOH调pH值至6.5，用针式过滤器过滤除菌，4℃储存。
（如果上述pH值在一开始时就偏碱，可以用冰乙酸回调）
二、操作步骤：
全过程冰上4℃操作，4℃离心，无菌操作。
划板。挑取宿主菌，在AMP-的LB琼脂糖培养基平板上划线，37℃培养16h。
1、 从过夜培养的不含氨苄的LB平板上挑单个大菌落，接种到5毫升LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养过夜。
2、 按1：100将500ul培养物接种到50毫升不含氨苄、预热的LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养至OD600=0.45～0.5（约需2～2.5小时）。
3、 0℃（冰上）预冷15分钟。
4、 4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。弃上清，用15ml TFB1悬浮菌体（涡旋振荡）。冰上放置15分钟。准备1.5毫升离心管30个，冰上预冷。
5、 4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。弃上清，用3ml TFB2悬浮菌体（涡旋振荡）。冰上放置15分钟。
6、 按100ul/管，将细菌在冰上分装到预冷的离心管（1.5ml）中，转入-80℃冰箱储存。
注：用质粒验证感受态细胞。
其实上面有些操作是可以在制备时灵活运用的：
1、用来过滤灭菌TFB的注射器是可以重复使用的，但是过滤器（0.2微米）只能使用一次；
2、比较关键的是将感受态细胞摇菌至OD 0.45～0.6，操作中说时间一般需要2～2.5个小时，我在做的时候也没有再去测过OD，怕污染，所以一般都将时间控制在2小时15分钟左右；
3、另外，做多了就要记得OD在0.45～0.6之间时，菌液的混浊程度，可能一开始比较难掌握，做多了就明白了，这个没有什么技巧，只能靠个人判断，所以当你不选择测OD而按照时间来操作时，判断菌液的混浊程度也是避免出现较大的错误；
4、做了这么多次，感觉最重要的还是要避免阳性菌的污染，做好感受态并做了验证之后留一些做为下一次划板用的菌种，保存好，千万不要让别人拿去用；
5、一开始做转化时，在将感受态细胞冰上解冻后发现里面的液体不是均匀的，似乎有些类似沉淀的东西，结果重复了几次转化都做不出来，所以这样的感受态应该是有问题的；
6、在用TFB2溶解菌体沉淀后，如果液体呈非常好看的乳白色，那么这个感受态的生长活力应该是没问题的（个人经验）；
7、关于分装。有时候做了上百管，而且EP管又要提前预冷，又得在超净工作台中，所以得为这个EP管怎么放置烦——可以先将EP管架埋在冰盒（选较大的）中，拥冰塞满覆盖到架子顶部，然后提前放到超净台中紫外杀菌（有个师兄一直叫我不要把冰盒放到超净台中的，不过没办法），然后将EP管打开盖子插到架子中，一并紫外杀菌，分装的时候就等全部分装完再合盖立即丢进-80℃冰箱（有些说先丢进液氮速冻再拿出来会更好，不过没试过）。记得标明制作日期和制备人。
