引物长度
一般引物的长度为15-30 bp，常用的长度为18-21bp。过长或过短都不合适，为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应，长度大于24 核苷的引物并不意味着更高的特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（18bp的序列在人类基因组中只会出现一次）。
碱基分布的均衡性
同一碱基连续出现不应超过5个
GC含量一般40-60%，以45-55％为宜
•GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性
引物Tm值
一般要求：55℃-65℃。
应尽可能保证上下游引物Tm值一致，一般差异控制在2 ℃以内。（引物的退火温度相差小于5℃一般不会影响PCR的产率，理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～80℃间变化，有说接近72℃为最佳）
上下游引物Tm值与产物Tm值一般应控制在20 ℃以内。
引物二级结构
§引物二聚体（引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性）
•尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补
发夹结构（引物自身连续互补碱基不能大于3bp）
尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。
（两项结构的能值以不超过4.5为好，引物中间或5’端可适当放宽）
引物的内部稳定性
过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。
现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3’端尽可能选用A或T（有说不适宜用A），少用G或C。
一般采用较低引物Tm值-5℃作为PCR退火温度。
GC含量太高也易于引发非特异扩增。
若模板不很清楚，引物3’端最后一个碱基最好为T，其次是G或C，而不选A，国外资料表明，当末位为T时，即使在错配的情况下也能引发链的合成，而末位为A时，错配时引发大大降低，G或C居中，可见，模板很清楚时选A可以提高特异性。
