真武汤抗大鼠肾间质纤维化作用的实验研究
邱模炎①，姜 岳②，赵宗江③， 李葆青① ，高杰东④ ，申丽红①，杨美娟③，陈永德①，郭洁①，吴蔚①
[摘要] 目的：观察真武汤对肾间质纤维化大鼠的作用，并通过观察真武汤对肾脏Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维的影响，探讨真武汤抗肾间质纤维化的作用机制。方法: 采用“单肾切除加腺嘌呤灌胃法”建立大鼠慢性肾衰竭模型。治疗组予真武汤灌胃治疗，对照组予尿毒清溶液灌胃治疗。给药4周后处死取血测SCr、BUN、血钙、血磷，肾脏石蜡切片分别进行HE染色、PASM染色、Masson染色、Sirius Red染色、Mallory染色，光镜下观察大鼠肾组织5种染色的病理形态学改变，HE染色进行肾小管间质病变半定量分析，PASM染色、Masson染色、Sirius Red染色分别进行肾脏组织病理学图像分析。结果:在肾间质纤维化面积、肾小球系膜积分光密度值等方面，真武汤大、小剂量组的作用优于模型组、尿毒清组，P<0.05。真武汤大、小剂量组在肾间质中I、Ⅲ型胶原分布面积等方面的作用与模型组对比，P<0.05。结论:真武汤具有抗肾间质纤维化的作用，其作用途径与抑制I、Ⅲ型胶原纤维增生有关。
[关键词] 真武汤 慢性肾衰竭 大鼠 肾间质纤维化
Effect of Zhenwu decoction on renal interstitial fibrosis in rats
Qiu moyan, Jiang yue, Zao zongjiang，Sun hui
Wangjing hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing (100102)
ABSTRACT Objective：Observing the protective effect of Zhenwu decoction on renal interstitial fibrosis in rats, to explore the role of anti - renal fibrosis and I, III collagen fibers affected in renal fibrosis of rat. Methods:Using model of Traditional Chinese Medicine syndrome of yang asthenia of Spleen and Kidney binding CRF of rats. Niaoduqing control group gavaged by Niaoduqing solution, Zhenwu decoction group gavaged by Zhenwu decoction concentrated solution, up to 28 days. After 4 weeks, blood samples taken from the femoral artery. Serum creatinine, blood urea nitrogen, serum calcium and phosphorus were detected. Renal pathology staining of paraffin sections carried on Hemotoxylin and eosin staining, Periodic Acid-Silver Methenamine staining,Masson staining,Sirius red staining, Mallory staining, and they were observed in renal morphological changes. HE staining was randomly selected for semi-quantitative analysis in tubulointerstitial lesions. Periodic Acid-Silver Methenamine staining,Masson staining,Sirius red staining, Mallory staining were randomly selected for kidney pathology image analysis. Results:In PASM mesangial integral optical density quantitative model of mesangial proliferative,Masson staining fibrosis in the area of renal interstitial, Low-dosage Zhenwu decoction and High-dosage Zhenwu decoction group better than model group, Niaoduqing control group，P<0.05. Low-dosage Zhenwu decoction and High-dosage Zhenwu decoction
① 中国中医科学院望京医院（北京 100102）
② 北京市朝阳区太阳宫社区卫生服务中心 （北京 100028）
③ 北京中医药大学（北京 100028）
④ 福建省安溪县中医院
group less than model group in renal interstitial of type I and III distribution area，P<0.05.Conclusions:Zhenwu decoction shows effect of anti-renal interstitial fibrosis. And it inhibit I, III collagen fibers proliferation, which may be Zhenwu decoction on renal interstitial fibrosis and chronic renal failure mechanism of the development process.
KEY WORDS Zhenwu decoction, Chronic renal failure, Rat, Renal tubulointerstitial fibrosis
通过对57年来真武汤防治慢性肾衰竭的临床和实验研究文献的整理研究，发现真武汤是中医临床治疗脾肾阳虚型慢性肾衰竭的常用方剂之一，但尚未见真武汤原方抗肾间质纤维化作用的报道[1]。本研究采用符合中医脾肾阳虚证候特征的慢性肾纤维化病证结合动物模型，观察真武汤对肾间质纤维化大鼠的作用以及对肾脏Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维的影响。
材料与方法
1 实验材料
1.1 动物 Wistar雄性健康大鼠 65只，6周龄，清洁级，体重200±20g，由中国医学科学院实验动物研究所提供（合格证号：SCXR京：2005－0013）。
1.2 实验药物
1.2.1 造模药物：腺嘌呤，购自北京化学试剂公司，用前将其加入蒸馏水中配制成20mg/ml的混悬液。
1.2.2 治疗药物：真武汤参考全国高等医药院校教材《方剂学》（第5版）组方：炮附片9g、茯苓9g、白芍9g、白术6g、生姜9g，将此剂量设为正常成人60kg体重的1日剂量，再根据文献[2]的方法进行大鼠用药剂量的换算，以正常人60kg体重用药剂量的3.5倍为小剂量，制备成含生药量为0.245g/ml的小剂量浓缩液；正常人60kg体重用药剂量的14倍为大剂量，制备成含生药量为0.98g/ml的大剂量浓缩液。
1.2.3 阳性对照药物：尿毒清颗粒由广州康臣药业有限公司生产（批号：20060207）。根据文献[3]，大鼠使用尿毒清的剂量为3.75g/kg。将尿毒清颗粒以蒸馏水配制成含药量为375mg/ml的溶液。
2实验方法
2.1 模型制作方法
采用“单肾切除加腺嘌呤灌胃法”建立大鼠慢性肾衰竭模型[4]。大鼠行左肾切除术1周后，每天以200mg·kg－1·d－1剂量的腺嘌呤混悬液灌胃造模，连续28天。
2.2 随机分组方法
65只大鼠根据体重按随机数字表法随机抽取10只作为正常组，10只作为假手术组，45只行左肾全切术。术中及术后1周死亡大鼠5只，术后1周，将存活的40只大鼠根据体重按随机数字表法随机分为模型组、真武汤小剂量组、真武汤大剂量组、尿毒清组各10只。
2.3 给药方法
治疗各组于术后分组当天开始，每天灌胃给药直至第28天。尿毒清组按3.75g·kg－1·d－1的剂量给药，真武汤大剂量组按9.8g·kg－1·d－1的剂量给药，真武汤小剂量组按2.45g·kg－1·d－1的剂量给药。
2.4 观察指标
2.4.1 血生化：给药4周后，从股动脉抽取血样测血肌酐、尿素氮、血钙、血磷。
2.4.2 病理染色方法：肾脏石蜡切片，分别进行苏木素伊红（HE）染色、六胺银（PASM）染色、马松（Masson）染色、天狼星红（Sirius Red）染色、Mallory染色，光镜下观察大鼠肾组织5种染色的病理形态学改变。
2.4.3肾小管间质病变半定量分析方法：根据Sergio的半定量分级标准，随机选取HE染色每组镜下的20个视野，进行半定量分析。
2.4.4肾脏组织病理学图像分析方法：在每组PASM染色切片包含肾小球的区域，随机选取200倍光镜下10个视野，用MetaMorph 图像分析系统对所选取视野中PASM染色肾小球系膜阳性目标光密度值进行测定。每组Masson染色切片在光镜200倍视野下分别观察10个互不重叠的皮质视野，借助HMIAS－2000高清晰彩色病理图文报告分析系统拍照，计算纤维化的面积(每张切片测量10个视野，取平均值) 占整个视野间质面积（排除肾小球、肾小管、血管所占面积）的百分比值。在偏振光显微镜200倍视野下，观察天狼星红染色各组切片10个互不重叠的皮质视野中的I和Ⅲ型胶原，并采用OLYMPUS－DP60高清晰彩色病理图象分析系统分析。
2.5 统计学方法：应用SPSS（V 15.0）统计软件进行统计学处理分析。所有计量资料以均数±标准差（ ）表示，不同组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较用LSD检验法，方差不齐时采用秩和检验。等级资料的比较采用秩和检验。P值<0.05认为差异有显著性意义。
结 果
1 血清肌酐、尿素氮、钙、磷情况：治疗各组SCr较模型组显著降低，P<0.05；尿毒清组、真武汤大剂量组BUN比模型组显著降低，P<0.05，而真武汤小剂量组BUN较模型组无明显差异；真武汤大剂量组、真武汤小剂量组血钙比模型组升高，P<0.05，而尿毒清组血钙较模型组无明显差异；治疗各组血磷较模型组显著降低，P<0.05；其中以真武汤大剂量组的作用最明显，见表1。
表1 血液生化检查比较表（ ）
组别
n
SCr（μmol/L）
BUN(mmol/L)
Ca2+(mmol/L)
P3+(mmol/L)
正常组
10
65.98±11.02＃△
6.71±0.4＃△
2.35±0.12＃
1.34±0.14＃
假手术组
10
66.95±11.39＃△
7.64±1.21＃△
2.46±0.30＃△
1.32±0.13＃
模型组
6
251.33±42.78*△
35.58±12.9*△
2.16±0.03*
1.54±0.11*△
尿毒清组
6
208.28±38.70*＃
26.19±4.69*＃
2.25±0.01
1.39±0.08＃
真武汤大剂量组
6
203.12±30.10*＃
26.16±3.19*＃
2.45±0.05＃△
1.35±0.11＃
真武汤小剂量组
6
209.98±20.42*＃
27.83±4.58*
2.43±0.06＃△
1.36±0.12＃
注：与正常组比较，* P<0.05；与模型组比较，＃P<0.05；与尿毒清组比较，△P<0.05。以下各表同注。
2 肾脏大体观察情况：模型组右肾明显增大，苍白色，质地坚硬无光泽，皮质明显变薄、皮髓质分界不清，包膜增厚。真武汤大、小剂量组右肾轻度增大，浅褐色，质地较硬无光泽，皮质变薄、皮髓质分界线可辨，包膜增厚。尿毒清组右肾轻度增大，浅褐色，质地较硬无光泽，皮质变薄、皮髓质分界不清，包膜增厚。
3 肾组织病理学情况表：见表2。
表2 肾脏组织病理学情况
组别
肾小球
肾小管
肾间质
正常组
系膜细胞无增殖
上皮细胞正常，无灶状萎缩及肥大
未见单核细胞浸润
假手术组
系膜细胞无增殖
上皮细胞正常，无灶状萎缩及肥大
未见单核细胞浸润
模型组
部分呈轻度系膜增殖
大量上皮细胞坏死、变性，大部分肾小管极度扩张，内有大量腺嘌呤结晶沉积，管腔内有蛋白管型
有大量炎细胞浸润，重度纤维组织增生
尿毒清组
部分呈轻度系膜增殖
少量上皮细胞坏死、变性，大部分肾小管轻度扩张，内有少量腺嘌呤结晶沉积
有少量炎细胞浸润，轻度纤维组织增生
真武汤大剂量组
少量呈轻度系膜增殖
少量上皮细胞坏死、变性，大部分肾小管轻度扩张，内有少量腺嘌呤结晶沉积
有少量炎细胞浸润，轻度纤维组织增生
真武汤小剂量组
部分呈轻度系膜增殖
少量上皮细胞坏死、变性，大部分肾小管中度扩张，内有少量腺嘌呤结晶沉积
有少量炎细胞浸润，轻度纤维组织增生
4 肾小管间质病变半定量分级情况：尿毒清组、真武汤小剂量组、真武汤大剂量组的肾小管间质损害较模型组轻，P<0.01；而真武汤大剂量组与尿毒清组的肾小管间质损害比较接近，P=0.05，且比真武汤小剂量组的肾小管间质损害要轻，P<0.05，见表3。
表3 肾小管间质病变半定量分级情况
组别
0级
Ⅰ级
Ⅱ级
Ⅲ级
正常组
20
0
0
0
假手术组
20
0
0
0
模型组
0
0
3
17
尿毒清组
0
8
11
1
真武汤小剂量组
0
12
7
1
真武汤大剂量组
0
14
6
0
5 PASM染色肾小球系膜积分光密度值定量情况：模型组系膜增生最明显，阳性目标积分光密度值最大，与正常组比较，有显著差异，P<0.05；各治疗组系膜增生轻于模型组，P<0.05；而真武汤大、小剂量组的系膜增生显著轻于尿毒清组，P<0.05，见表4。
表4 PASM染色肾小球系膜积分光密度值情况（ ）
组别
系膜积分光密度值
正常组
33.77±9.83＃
假手术组
25.68±7.49*＃△
模型组
266.78±58.22*△
尿毒清组
139.44±19.02＃
真武汤小剂量组
59.15±29.27＃△
真武汤大剂量组
61.23±16.79＃△
6 Masson染色肾间质纤维化面积情况：模型组的纤维化面积最大，所占肾间质面积的百分比最高，与正常组比较，有显著差异，P<0.05；真武汤大、小剂量组肾间质中纤维化面积显著低于模型组，P<0.05；而尿毒清组的肾间质中纤维化面积虽然也低于模型组，但无显著差异，P>0.05，真武汤大、小剂量组肾间质中纤维化面积显著低于尿毒清组，P<0.05，见表5。
表5 Masson染色肾间质纤维化面积百分比（ ）
组别
纤维化面积百分比
正常组
11.40±7.73＃△
假手术组
12.10±6.99＃△
模型组
56.10±18.34*
尿毒清组
52.90±9.48*
真武汤小剂量组
39.90±9.34*＃△
真武汤大剂量组
25.70±6.25*＃△
7 Sirius red染色I和Ⅲ型胶原的分布面积情况：模型组肾间质中I、Ⅲ型胶原分布面积较大，与正常组比较，有显著差异，P<0.05。真武汤大剂量组、真武汤小剂量组、尿毒清组肾间质中I型胶原分布面积显著小于模型组，P<0.05；而真武汤大剂量组、真武汤小剂量组、尿毒清组的肾间质中Ⅲ型胶原分布面积显著小于模型组，P<0.05。真武汤大、小剂量组肾间质中I、Ⅲ型胶原分布面积小于尿毒清组，但无显著差异，P>0.05，见表6。
表6 Sirius red染色I和Ⅲ型胶原的分布面积百分比情况（ ）
组别
I型胶原的分布面积百分比
Ⅲ型胶原的分布面积百分比
正常组
1.27±0.69＃
0.46±0.08＃△
假手术组
0.94±0.51＃△
0.56±0.12＃△
模型组
5.45±3.05*△
1.81±0.47*△
尿毒清组
1.96±1.17＃
1.38±0.07*＃
真武汤小剂量组
1.92±1.33＃
1.28±0.63*＃
真武汤大剂量组
1.66±0.93＃
1.24±0.78*＃
讨 论
本实验病理染色结果显示：大鼠单肾切除术加腺嘌呤灌胃法建立的慢性肾衰竭模型出现肾间质重度纤维化增生，肾间质可见大量炎细胞浸润，与文献报道相符[5]。Masson染色肾间质纤维化面积的定量分析结果显示：模型组的纤维化面积最大，所占肾间质的百分比最高，与正常组比较，有显著差异，P<0.05；说明该模型可出现肾间质重度纤维化。Masson染色真武汤大剂量组、真武汤小剂量组肾间质中纤维化面积占的百分比显著低于模型组，P<0.05；真武汤大剂量组、真武汤小剂量组肾间质中纤维化面积占的百分比显著低于尿毒清组，P<0.05。说明真武汤有抗肾间质纤维化的作用。近年来，肾小管间质的损害日益受到国内外学者的重视。肾小管间质纤维化程度预示着肾功能受损程度，决定着慢性肾衰竭的预后。肾小管上皮细胞损伤、肥大及细胞的高代谢，使残余肾单位肾小管代谢亢进导致肾小管耗氧量增加和氧自由基生成增多，而致肾小管扩张，炎性细胞浸润，间质纤维化。因此，无论是肾小球疾病或小管间质疾病，减轻肾小管间质损害是延缓疾病进展的关键所在[6]。因此，真武汤的抗肾间质纤维化作用对慢性肾衰竭大鼠肾脏的保护具有重要意义。
肾纤维化是各种肾脏疾病发展到慢性肾衰竭的共同途径，在肾脏病的进展过程中起重要作用。肾小管间质损伤在肾脏病的进展过程中起重要作用，肾小球病变程度相同的患者，如果小管病变程度不同，预后可相差很大。肾间质纤维化是指细胞外基质，主要是I型、Ⅲ型胶原的增加和沉积，其主要病理表现是肾小管上皮细胞减少和间质中出现大量肌成纤维细胞[7]。现已知肌成纤维细胞除能由成纤维细胞分化产生外，也能部分地来源于血管周细胞的增生和迁移及肾小管上皮细胞在病理状态下的转分化。肌成纤维细胞能合成及分泌I、Ⅲ型胶原，促进肾间质纤维化的发生[8]。邹万忠等采用腺嘌呤致大鼠肾小管间质纤维化实验模型，发现给药3天后腺嘌呤代谢产物2，8-二羟基腺嘌呤结晶沉积于肾小管，受累小管变性坏死，间质内可见中性粒细胞为主的炎细胞浸润；给药 1～2周，受累小管不断增多，间质中性粒细胞渐少，淋巴细胞和单核细胞逐渐增多；给药 3～5周，各级肾小管弥漫扩张，上皮萎缩，间质弥漫淋巴单核细胞浸润，成纤维细胞增生，细胞外基质大量形成，出现肾小管间质纤维化。其中，给药3～5周时，2，8-二羟基腺嘌呤结晶周围形成以单核巨噬样细胞增生为特征的肉芽肿性病变[9]。肾间质纤维化和肉芽肿形成，可压迫小管间毛细血管，使管腔狭窄，血管阻力增加，肾小球血流量减少，导致进行性肾功能损害。因此，抑制炎症反应和促炎症细胞因子的分泌，以抑制胶原的合成，是防治肾间质纤维化的关键[7]。
本实验研究发现正常组、假手术组肾间质 I、Ⅲ型胶原染色较弱，肾小球系膜及基底膜染色为阴性。造模后各组肾间质 I、Ⅲ型胶原染色明显增强，但肾小球系膜及基底膜区域染色为阴性。模型组I、Ⅲ型胶原增生较多，与正常组比较，有显著差异，P<0.05。真武汤大剂量组、真武汤小剂量组、尿毒清组肾间质中I型胶原增生显著低于模型组，P<0.05；而真武汤大剂量组、真武汤小剂量组、尿毒清组的肾间质中Ⅲ型胶原增生显著低于模型组，P<0.05。可见，真武汤抑制I、Ⅲ型胶原纤维的增生是抗肾间质纤维化作用的重要途径，但真武汤抑制I、Ⅲ型胶原纤维增生的机理，仍有待今后进一步研究。
参 考 文 献
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4．赵宗江，魏晨，杨美娟，等.温脾汤对腺嘌呤性慢性肾衰竭大鼠肾功能的保护作用.山东中医药大学学报，2005，29（6）：461～464.
5．孙锁柱，徐曼，邹万忠.肾小管间质纤维化中成纤维细胞的转化生长因子β1及其I型受体蛋白及基因表达检测.临床与实验病理学杂志，2000，16（2）：134～136.
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