绿茶抗大鼠肾间质纤维化作用的实验研究
邱模炎1，姜岳2，孙慧1
（1 中国中医科学院望京医院，北京 100102；2北京市朝阳区太阳宫社区卫生服务中心，北京 100028）
摘要：目的观察绿茶抗肾间质纤维化的作用以及对肾间质纤维化大鼠肾脏Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维的影响。方法采用“单肾切除加腺嘌呤灌胃法”建立大鼠慢性肾衰竭模型。治疗组予绿茶液灌胃治疗，对照组予尿毒清溶液灌胃治疗。给药4周后处死，肾脏石蜡切片分别进行HE染色、PASM染色、Masson染色、Sirius Red染色、Mallory染色，光镜下观察大鼠肾组织5种染色的病理形态学改变，HE染色进行肾小管间质病变半定量分析，PASM染色、Masson染色、Sirius Red染色进行肾脏组织病理学图像分析。结果绿茶组在肾间质纤维化面积、肾小球系膜积分光密度值、肾间质中I、Ⅲ型胶原分布面积等方面的作用与模型组对比，P<0.05。绿茶能够减轻腺嘌呤对大鼠肾脏的病理损害，并具有抗肾间质纤维化的作用。结论绿茶有抑制I、Ⅲ型胶原纤维增生的作用，这可能是绿茶防治肾间质纤维化、延缓慢性肾衰竭发展进程的机制之一。
关键词：绿茶 慢性肾衰竭 大鼠 肾间质纤维化
注：本文转载自：《茶叶科学》，2008，28（5）：353-357.
目前对非药物疗法的研究越来越多，非药物疗法以其使用安全而受到广泛关注。在慢性肾衰竭的治疗上，中医非药物疗法被广泛使用。绿茶饮用十分广泛，茶多酚是从绿茶中提取出来的有效成分，是由茶叶中的黄烷醇类、花色素类、花黄素类、缩酸及缩酚酸类组成的化合物，可以防止免疫过强和炎症反应，抑制细胞和机体脂质过氧化，从而能够抑制肾病的发生；同时茶多酚还可抗凝、抗血栓、改善血液流变学，从而可以预防肾病进展，改善慢性肾功能不全的症状。Manabu等研究表明摄入绿茶可改善慢性肾衰竭的症状[1]。但目前尚无绿茶防治慢性肾衰竭的实验研究，有必要开展绿茶防治慢性肾衰竭的实验研究。
1 实验材料
1.1 实验动物
Wistar雄性健康大鼠 65只，6周龄，清洁级，体重200±20g，由中国医学科学院实验动物研究所提供（合格证号：SCXR京：2005－0013）。
1.2 实验药物
1.2.1造模药物：腺嘌呤，购自北京化学试剂公司，用前将其加入蒸馏水中配制成20mg/ml的混悬液。
1.2.2治疗药物：绿茶为信阳毛尖，河南省信阳市云雾赛山茶厂2006年出品。根据文献[2]的方法，取正常人60kg体重用药剂量的7倍为大鼠剂量，人用剂量为10g/60kg，则每100g大鼠每日剂量为：0.17g。用90℃初开沸水冲泡茶叶3～5分钟，泡好冷却过滤，再浓缩制成含生药量为0.12g/ml的浓缩液。盛于消毒干净磨口玻璃瓶中，密封储存于4℃冰箱内备用。
1.2.3阳性对照药物：尿毒清颗粒由广州康臣药业有限公司生产，批号：20060207。根据文献[3]，大鼠使用尿毒清的剂量为3.75g/kg。将尿毒清颗粒以蒸馏水配制成含药量为375mg/ml的溶液。
2实验方法
2.1 模型制作方法：采用“单肾切除加腺嘌呤灌胃法”建立大鼠慢性肾衰竭模型[4]。大鼠行左肾切除术1周后，每天以200mg·kg－1·d－1剂量的腺嘌呤混悬液灌胃造模，连续28天。
2.2 随机分组方法：55只大鼠根据体重按随机数字表法随机抽取10只作为正常组，10只作为假手术组，35只行左肾全切术。术中及术后1周死亡大鼠5只，术后1周，将存活的30只大鼠根据体重按随机数字表法随机分为模型组、绿茶组、尿毒清组各10只。
2.3 给药方法：正常组、假手术组、模型组：于分组当天开始每天灌胃2ml蒸馏水，直至第28天。治疗各组于术后分组当天开始，每天灌胃直至第28天。尿毒清组按3.75g·kg－1·d－1的剂量给尿毒清溶液，绿茶组按1.7g·kg－1·d－1的剂量给绿茶液。
2.4 观察指标
2.4.1病理染色方法：肾脏石蜡切片，分别进行苏木素伊红（HE）染色、六胺银（PASM）染色、马松（Masson）染色、天狼星红（Sirius Red）染色、Mallory染色，光镜下观察大鼠肾组织5种染色的病理形态学改变。
2.4.2肾小管间质病变半定量分析方法：根据Sergio的半定量分级标准，随机选取HE染色每组镜下的20个视野，进行半定量分析。
2.4.3肾脏组织病理学图像分析方法：在每组PASM染色切片包含肾小球的区域，随机选取200倍光镜下10个视野，用MetaMorph 图像分析系统对所选取视野中PASM染色肾小球系膜阳性目标光密度值进行测定。每组Masson染色切片在光镜200倍视野下分别观察10个互不重叠的皮质视野，借助HMIAS－2000高清晰彩色病理图文报告分析系统拍照，计算纤维化的面积(每张切片测量10个视野，取平均值) 占整个视野间质面积（排除肾小球、肾小管、血管所占面积）的百分比值。在偏振光显微镜200倍视野下，观察天狼星红染色各组切片10个互不重叠的皮质视野中的I和Ⅲ型胶原，并采用OLYMPUS－DP60高清晰彩色病理图象分析系统分析。
2.5 统计学方法：应用SPSS（V 15.0）统计软件进行统计学处理分析。所有计量资料以均数±标准差（）表示，不同组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较用LSD检验法，方差不齐时采用秩和检验。等级资料的比较采用秩和检验。P<0.05认为差异有显著性意义；P<0.01认为差异有非常显著性意义。
3 结果
3.1 肾脏大体观察情况表：见1。
表1 肾脏大体观察情况
组别
肾脏体积
颜色
质地
切面
包膜
正常组
正常
褐红色
坚实有光泽
正常
紧密
假手术组
正常
褐红色
坚实有光泽
正常
已剥离
模型组
右肾明显增大
灰褐色
坚硬无光泽
皮质明显变薄，
增厚
尿毒清组
右肾轻度增大
浅褐色
较硬无光泽
皮髓质分解不清
增厚
绿茶组
右肾轻度增大
浅褐色
较硬无光泽
皮髓质分解不清
增厚
3.2 肾组织病理学情况表：见2。
表2 肾脏组织病理学情况
组别
肾小球
肾小管
肾间质
正常组
系膜细胞无增殖
上皮细胞正常，无灶状萎缩及肥大
未见单核细胞浸润
假手术组
系膜细胞无增殖
上皮细胞正常，无灶状萎缩及肥大
未见单核细胞浸润
模型组
部分呈轻度系膜增殖
大量上皮细胞坏死、变性，大部分肾小管极度扩张，内有大量腺嘌呤结晶沉积，管腔内有蛋白管型
有大量炎细胞浸润，重度纤维组织增生
绿茶组
少量呈轻度系膜增殖
少量上皮细胞坏死、变性，大部分肾小管轻度扩张，内有少量腺嘌呤结晶沉积
有少量炎细胞浸润，轻度纤维组织增生
尿毒清组
部分呈轻度系膜增殖
少量上皮细胞坏死、变性，大部分肾小管轻度扩张，内有少量腺嘌呤结晶沉积
有少量炎细胞浸润，轻度纤维组织增生
3.3 PASM染色肾小球系膜积分光密度值定量比较情况
模型组的阳性目标积分光密度值最大与正常组比较，有显著差异，P<0.05；各治疗组的阳性目标积分光密度值显著低于模型组，P<0.05；而绿茶组的阳性目标积分光密度值显著低于尿毒清组，P<0.05。见表4－9
表3 PASM染色肾小球系膜积分光密度值的比较（）
组别
系膜积分光密度值
正常组
33.77±9.83＃
假手术组
25.68±7.49*＃△
模型组
266.78±58.22*△
尿毒清组
139.44±19.02＃
绿茶组
72.66±48.67＃△
注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，＃P<0.05；与尿毒清组比较，△P<0.05。以下各表同注。
3.4 Masson染色肾间质纤维化面积的定量比较情况
模型组的纤维化面积最大，所占肾间质的百分比最高，与正常组比较，有显著差异，P<0.05；尿毒清组、绿茶组的肾间质中纤维化面积占的百分比虽然也低于模型组，但无显著差异，P>0.05。见表4－10。
表4 Masson染色肾间质纤维化面积百分比（）
组别
纤维化面积百分比
正常组
11.40±7.73＃△
假手术组
12.10±6.99＃△
模型组
56.10±18.34*
尿毒清组
52.90±9.48*
绿茶组
50.40±8.79*
3.5 Sirius red染色I和Ⅲ型胶原的分布面积百分比比较情况
模型组I、Ⅲ型胶原增生较多，与正常组比较，有显著差异，P<0.05。尿毒清组肾间质中I、Ⅲ型胶原增生显著低于模型组，P<0.05；绿茶组肾间质中Ⅲ型胶原增生显著低于模型组，P<0.05；结果见表4－11。
表5 Sirius red染色I和Ⅲ型胶原的分布面积百分比（）
组别
I型胶原的分布面积百分比
Ⅲ型胶原的分布面积百分比
正常组
1.27±0.69＃
0.46±0.08＃△
假手术组
0.94±0.51＃△
0.56±0.12＃△
模型组
5.45±3.05*△
1.81±0.47*△
尿毒清组
1.96±1.17＃
1.38±0.07*＃
绿茶组
2.61±0.88*
1.13±0.56*＃
4讨论
茶叶作为简便、廉价的天然饮料已食用了数千年。近几十年来对茶叶的有效成分进行了广泛的研究，并提取出有效成分进行了对慢性肾衰竭的临床与实验研究。茶多酚是从绿茶中提取出来的有效成分，是由茶叶中的黄烷醇类、花色素类、花黄素类、缩酸及缩酚酸类组成的化合物，主要成分是黄烷－3－醇衍生物，俗称儿茶素。对茶多酚在肾病中的防治作用已经有了不少研究成果[4-9]。杨贤强认为茶多酚具有益气化瘀、解毒泄浊等功效，可以起到防治肾病的作用[4]。
本实验还发现绿茶可减轻腺嘌呤对肾脏的损害，病理结果显示绿茶组大鼠肾小管结构正常、轻度扩张，TEC比较完整，肾小管内有少量嘌呤代谢产物结晶沉积，间质有少量炎细胞浸润、轻度纤维化，肾小囊腔正常，肾小球系膜细胞轻度增生。PASM染色肾小球系膜积分光密度值显著低于尿毒清组，P<0.05；Masson染色肾间质纤维化程度也低于模型组；Sirius red染色绿茶组肾间质中Ⅲ型胶原增生显著低于模型组，P<0.05；可见绿茶还具有一定的抗肾纤维化的作用。
以上显示了茶疗作为非药物疗法之一在防治慢性肾衰竭方面发挥了其独特的作用，中医强调“不治已病治未病”，采用早期预防、早期治疗对于控制疾病的发展具有重要意义。可见绿茶在防治早期慢性肾衰竭方面具有广泛的运用前景，对其具体疗效产生的机制还需要继续深入研究。
参 考 文 献
1 Manabu N, Nobuyuki A, Mujo K.Fragrance J, 1997，25（4）：41.
2贲长恩主编.医学科研基本思路方法与科研程序.北京：科学出版社，2003：161.
3邓虹珠，陈志良，石兴华，等.中药尿毒清冲剂治疗大鼠慢性肾衰的实验观察.第一军医大学学报，1993，13（1）：6～11.
4 杨贤强.茶叶对人类的新贡献.茶叶，1996，22（3）：42.
5 胡秀芳.茶儿茶素对肾病的药效及其机理研究：[博士论文].杭州：浙江大学，2001.
6 Yokozawa T, Chung HY, He LQ .Effectiveness of green tea tannin on rats with chronic renal failure. Biosci Biotechnol Biochem. 1996，60(6):1000-5.
7 Yokozawa T, Oura H, Hattori M. Inhibitory effect of tannin in green tea on the proliferation of mesangial cells. Nephron. 1993，65(4):596-600.
8 晏双利，杨贤强.茶多酚的功效.绿色中国，2005，26（1）：70.
9 郑颜萍，陈裕盛，陈文，等.茶多酚对慢性肾功能不全抗脂质过氧化损伤.中华肾脏病杂志，1999，15（4）：256～257.
