本文转载自“丁香学术”微信公众号
T 细胞在人体抗击肿瘤过程中至关重要，而 CAR-T（嵌合抗原受体 T）细胞，即被基因工程改造的 T 细胞，具有针对癌细胞的定向特异性，是一种很有前景的治疗癌症的方法。对白血病和淋巴瘤细胞具有强大的杀伤作用，近年来发展迅猛、方兴未艾。
然而，CAR-T 疗法的毒副作用也不容忽视。CAR-T 在识别和杀伤肿瘤细胞时，是通过肿瘤细胞表面的抗原进行识别的，比如 CD19CAR-T 在治疗急性 B 淋巴细胞白血病的过程中，CAR-T 细胞通过识别肿瘤细胞表面的 CD19 抗原而杀伤肿瘤。
但是，正常的 B 细胞表面也表达 CD19 抗原，导致 CAR-T 细胞在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤了正常细胞。因此对 CAR-T 细胞进行高精度控制，使其杀伤癌细胞的同时减少对正常细胞的伤害是 CAR-T 疗法改进的重要方向。
超声波可以将机械能安全、无创地输送到身体表面数十厘米以下的部位。聚焦超声波（FUS）的快速振荡压力以及由此产生的机械能可使生物组织的局部发热。在磁共振成像（MRI）测温技术的帮助下，FUS 已在临床上被广泛应用于消融肿瘤和控制药物释放、血管舒张、神经调节和转基因表达等方面。然而，目前尚缺乏利用 FUS 在体内控制哺乳动物细胞功能的通用方法。
2021 年 8 月 12 日，来自加州大学圣地亚哥分校的 Shu Chien 团队和王英晓团队在 Nature Biomedical Engineering 在线发表了题为Control of the activity of CAR-T cells within tumours via focused ultrasound 的文章。
该研究开发了一类可诱导的 CAR-T 细胞，这些细胞可以在没有任何外源性辅因子的情况下由 FUS 直接控制。FUS 刺激可以在特定的时间和部位激活 CAR-T 细胞，从而在体内抑制肿瘤生长。该疗法的安全性高于现行的 CAR-T 疗法。
图片来源：Nature Biomedical Engineering
研究内容
热诱导 T 细胞中的 CD19CAR 表达
研究团队首先构建了一个包含热休克蛋白（Hsp）启动子的 eGFP 报告载体，这种载体在热诱导（43℃）下持续稳定表达 eGFP。为了将短暂的热刺激转化为持续的基因激活和细胞功能以发挥治疗作用，研究团队将 Cre–lox 基因开关整合到热诱导系统中，以在加热条件下表达针对 CD19 阳性肿瘤细胞的嵌合抗原受体（CD19CAR）。
接下来他们研究了热诱导表达的 CD19CAR 在细胞中的功能。将热诱导工程化 Jurkat 细胞（即热诱导的 CD19CAR-T 细胞）与表达 CD19 的 Nalm-6 肿瘤细胞共培养 24 小时，他们发现加热诱导了 T 细胞的早期活化。细胞毒性试验显示热诱导 T 细胞的肿瘤细胞毒性随着 E : T（effector-to-target）比率的增加而增加，证实了热诱导的 CAR-T 细胞获得了杀伤癌细胞的能力。
图片来源：Nature Biomedical Engineering
磁共振引导的聚焦超声波诱导基因激活
MRI 引导的 FUS 能够在局部区域范围内传递热能，研究团队将 FUS 系统与 7T 磁共振技术结合，用慢病毒双荧光素酶报告基因转染 Nalm-6 细胞，并将细胞嵌入一定深度的模具中。通过调整超声波焦距，将超声波聚焦在嵌入的细胞上。三次 5 分钟的 FUS 刺激脉冲可显著诱导基因表达，诱导水平与使用具有相同加热模式的热循环器的阳性对照相当，表明该方法可以高效地声学控制工程细胞中的基因激活。
接着，他们使用 MRI 引导的 FUS 控制体内的局部温度，并在小鼠体内使用 Nalm-6 细胞和双荧光素酶报告基因判断 FUS 诱导的基因激活。结果显示，仅用两次 5 分钟 FUS 刺激即可在注射细胞中观察到显著的基因诱导表达。
图片来源：Nature Biomedical Engineering
聚焦超声波诱导 CAR-T 细胞在体内的肿瘤细胞毒性
为了在体内测试 FUS 诱导型 CAR T（FUS-CAR-T）细胞的肿瘤细胞毒性，研究团队将工程化 CD19CAR-T 细胞注射进患前列腺癌或淋巴癌小鼠皮下的两侧肿瘤位置，然后在 43°C 条件下对左侧肿瘤进行 FUS 刺激。
结果表明，与右侧肿瘤相比，左侧肿瘤的生长明显受到抑制；同时，FUS 治疗的肿瘤中 CAR mRNA 表达显著升高，证明了 FUS 诱导了 CAR-T 细胞的产生和 CAR-T 细胞在体内的肿瘤细胞毒性。
图片来源：Nature Biomedical Engineering
FUS-CAR-T 细胞治疗的安全性
研究团队采用上述双侧肿瘤模型，局部注射相同数量的标准 CD19CAR-T 或 FUS 诱导型 CD19CAR-T 细胞治疗近端肿瘤，远端肿瘤用于模拟表达靶抗原的正常组织。标准 CAR-T 细胞消除了近端肿瘤，但同时还攻击了模拟正常组织的远端肿瘤。而 FUS-CAR-T 细胞显著抑制近端肿瘤的生长，但对远端肿瘤没有影响。
标准 CAR-T 细胞对近端和远端肿瘤的细胞毒性分别为 100% 和 99.8%；FUS-CAR-T 细胞对近端肿瘤的有效性为 95.7%，而对远端肿瘤的有效性仅为 9.8%。这些结果表明，FUS-CAR-T 细胞治疗更安全，与标准的 CAR-T 细胞治疗相比，靶向肿瘤外的细胞毒性显著降低。
图片来源：Nature Biomedical Engineering
开发一种临床相容性和可逆性的 FUS-CAR-T 细胞
为了在该技术中尽量减少使用外源性成分以获得更高的临床相容性，研究团队进一步设计了一种 FUS-CAR-T 细胞，其中 CAR 表达由 Hsp（Hsp-CAR）直接驱动，没有 Cre–lox 开关。
在第一轮热诱导（43°C, 15 分钟）后 6 小时，43.9% 的 Hsp-CAR-T 细胞表达 CAR，在 12 小时的时候下降到 10.5%，并在 24 小时后恢复到与未处理对照组相当的基础水平。当进行第二轮热诱导时，平均 44.2% 的细胞表达 CAR 表达，随后出现相同的降解动力学，表明 Hsp-CAR 系统的可逆性质。
双侧肿瘤模型治疗实验显示，与远端肿瘤相比，近端肿瘤的生长被显著抑制，表明可逆性 FUS-CAR-T 细胞具有足够的杀伤肿瘤的疗效和较小的副作用。这些结果证明了 Hsp 驱动的 FUS-CAR-T 细胞的可逆性、有效性和安全性，并且最大限度地减少了未经临床试验的外源性成分的使用。
图片来源：Nature Biomedical Engineering
总的来说，这项工作介绍了一种新的癌症免疫疗法--将超声波与经过特殊设计的 CAR-T 细胞相结合，以杀伤恶性肿瘤，同时减少对正常组织的伤害。
这项工作解决了癌症免疫治疗领域的一个长期问题：如何使 CAR-T 细胞疗法安全有效地治疗实体瘤。声遗传学控制将有助于设计更安全的细胞疗法。
延伸阅读
CAR-T 细胞作为一种治疗恶性肿瘤的新方法，至少有 500 项与之相关的临床试验正在开展。尽管 CAR-T 细胞显示出作为癌症治疗方法的美好前景，但人们仍然面临着 CAR-T 疗法安全性的挑战。
利用远程细胞控制和基因传递技术，科学家们正在开发远程调节 CAR-T 细胞生物学功能的技术。其中的一项技术--光遗传学，能够对体内的细胞和分子功能加以控制。
图片来源：Science Advances
2020 年，王英晓团队在 Science Advances 上发表了题为Engineering light-controllable CAR T cells for cancer immunotherapy 的论文，首次开发了一种光诱导核易位和二聚化 (LINTAD) 系统，用于基因调控以控制 CAR T 细胞的激活。然而，这种光遗传学存在一定局限性，它只能在数毫米的范围内发挥作用，难以抵达深层组织。
图片来源：Science Advances
本次新研究联合声遗传学和 CAR-T 疗法成功杀死了光遗传学无法触及的深部肿瘤细胞，加之 MRI 定位和热诱导，使得临床医生可以精准控制 CAR-T 的局部激活，在一定程度上保证了肿瘤治疗的安全性。
