尽管CRISPR相关的基因编辑技术带来了治疗甚至治愈多种疾病的希望，然而该技术依赖于DNA修复通路，该通路会以一种不可预知的方式将新的碱基插入到遗传密码中，因此难以把控最终的治疗效果。随着科学探索的日益深入，越来越多证据表明，对表观遗传进行编辑或许是一种更有潜力的方式，能够在不改变DNA序列的情况下精准控制基因表达。
最近，由加州大学旧金山分校的研究人员领导的一支研究团队设计了一种基于CRISPR的可编程表观基因组编辑蛋白CRISPRoff，能够在不影响遗传密码的情况下持久而特异性地沉默绝大多数蛋白质编码基因。并且被沉默的基因将在之后数百代的细胞中保持惰性，直至被CRISPRon重新打开。
这项题为“Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing”的报告发表在《Cell》期刊上。
https ://doi.org/10.1016/j.cell.2021.03.025
该报告的共同资深作者、加州大学旧金山分校海伦•迪勒家庭综合癌症中心教授Luke Gilbert说：“众所周知，细胞和基因疗法是未来医学的支柱，但是永久地改变人类基因组可能会造成无法挽回的后果，这驱使着我们探索基于CRISPR技术治疗疾病的更安全有效的方法。”
传统的CRISPR技术是由能够改变DNA序列的剪切酶以及能够被编程实现对剪切位置精准靶向的归巢装置组成。在这项试验中，研究人员在保留归巢装置的基础上，使用仅作用于表观基因组的酶代替DNA剪切酶，从而得到了一种能够靶向任何基因但不对其进行编辑的升级版CRISPR工具CRISPRoff。
这款新CRISPR工具是由锌指核酸酶ZNF10 的KRAB结构域、DNA甲基转移酶Dnmt3A（D3A）和Dnmt3L（D3L）的蛋白结构域分别融合于化脓性链球菌dCas9的N-/C-末端形成。为了产生更持久的基因沉默效果，研究人员还用蛋白水解抗性连接子编码该工具，从而最小化可能导致无约束的D3A-D3L和脱靶DNA甲基化的蛋白水解。
CRISPRoff的设计及优化
研究人员发现，CRISPRoff在诱导多能干细胞（iPSCs）、海拉细胞（HeLa）、人骨肉瘤细胞（U2OS）以及慢性粒细胞白血病癌细胞（K562）等多种细胞中起作用。该工具能够通过促进靶位点附近的DNA甲基化，实现长久且可遗传的基因作用，在以CLTA基因为靶点的单细胞克隆实验中，基因抑制效果至少持续了15个月，延伸到450次细胞周期。同时，多个测序分析表明，CRISPRoff还具有高度的特异性。
CRISPRoff对CLTA的抑制效果持续了至少15个月
表观基因组编辑的魅力之一在于，该工具具有可逆性，被关闭的基因能够重新被打开。先前的研究表明，TET（ten-eleven translocation）家族酶在DNA去甲基化过程中扮演着重要的作用。
为了评估CRISPRoff介导的基因沉默的可逆性，在这项试验中，研究人员将TET1与dCas9融合，并对融合蛋白进行优化，设计出了可去除甲基化标记的CRISPRon系统。在经CRISPRoff转染后CLTA受到抑制的细胞中，CRISPRon的使用能够在2天内重新激活CLTA表达，逆转DNA甲基化修饰和转录抑制。
DNA的碱基有腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）四种。2011年，《Genes & Development》发布的一篇文章提出，甲基化只能使基因组中CG序列高度集中的位点CpG岛（CGI）沉默，而人类基因中有近三分之一缺乏CGI，理论上CRISPRoff对这类基因无效。
然而，令研究人员惊讶的是，在试验过程中他们发现了300多个缺乏CGI的基因在经过CRISPRoff处理后基因转录受到抑制，并且后续的研究验证了CRISPRoff能够针对人类基因组中大多数基因进行表观遗传编辑，而这种对基因转录的持久抑制可能依赖于sgRNA靶位点附近组蛋白H3K9me3修饰和DNA甲基化修饰的形成。
报告的最后指出，CRISPRoff系统将有助于科研人员广泛地探索表观遗传抑制的生物学规律，并为控制基因表达、靶向增强子和探索表观遗传的原理提供了强有力的工具。当然，仍然需要更多的研究以挖掘CRISPRoff的治疗潜力。
参考资料：
1. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing
2. New CRISPR technology offers unrivaled control of epigenetic inheritance
