基本信息
论文题目：EBP1 nuclear accumulation negatively feeds back on FERONIA-mediated RALF1 signaling
EBP1的细胞核内积累负向作用于FERONIA调节的RALF1信号转导
发表期刊：PLOS Biology
发表时间：2018.10
影响因子：9.163
作者单位：湖南大学于峰教授
本文涉及的高通量技术：RNA-seq（由上海欧易生物提供服务）
研究背景
FERONIA (FER) 是细胞膜表面受体蛋白激酶，作为 RALF1 多肽信号的受体，可通过胞外域与 RALF1 直接结合来感受 RALF1 信号刺激并将该信号传递至细胞内，驱动一系列下游反应，包括抑制细胞质膜表面的氢泵活性(Arabidopsis H+-ATPase 2，AHA2)和调控细胞核内基因表达，来控制细胞生长，但其机制尚不清楚。
研究内容
本研究发现，通过与 RALF1 结合，FER 首先提高 ErbB3 结合蛋白1基因（ErbB3-binding protein 1，EBP1）的 mRNA 的转录本水平，并使得 EBP1 蛋白发生磷酸化和 EBP1 的细胞核内积累。EBP1 与先前鉴定的 RALF1 调控基因（如CML38）结合，来调控这些基因的转录，响应 RALF1 信号转导，形成 RALF1-FER-EBP1 的反应轴线。研究还发现 EBP1 能够抑制 RALF1 的多肽反应，形成转录本-翻译反馈回路（Transcription–translation feedback loop，TTFL）。
研究思路
研究结果
1.RALF1-FER 促进 EBP1 的 mRNA 转录，导致 EBP1 蛋白水平增加
Western blot 实验发现，RALF1 促进了 EBP 1蛋白的积累，且具有 FER 依赖性。通过 qPCR 发现，EBP1 mRNA 的表达量（转录水平上）并未受到 RALF1 的显著影响，而是通过某种机制和转录后调控相关。接着作者又利用 Polysome profiling 分析发现，RALF1 对EBP1 mRNA 翻译的促进作用取决于 FER，用环己酰亚胺（cycloheximide，CHX，一种mRNA翻译阻碍因子）阻碍蛋白的合成，发现 EBP1 不再积累。以上实验说明，RALF1 能够通过改变 EBP1 mRNA 的翻译，影响EBP1蛋白的积累。
图 |（A）经 RALF1 处理后的 Col-0 和 fer-4 两个植物实验组EBP1积累的时间过程，Actin 为对照组；（B-F）Polysome profiling 和 qRT-PC R分析EBP1 和 EIF4A1 mRNA 的翻译状态；（H）RALF1 (1 μM for 2 hours) 使 EBP1 mRNA 的翻译，CHX 作用后 EBP1 不再积累，Actin 为对照组
2.EBP1在核内积累和发生磷酸化
利用免疫印迹分析和免疫荧光检验分析，证明了 EBP1 在细胞核内积累。构建了一个脱落酸（ABA）诱导的体外磷酸化系统，分析得出EBP1是FER的磷酸化底物，受到 FER 激酶的作用而发生磷酸化，并进一步确定了 EBP1 的 10 个磷酸化位点。
图 | （A）EBP1 体外磷酸化分析。结果显示了磷酸化和去磷酸化的 FER-KD-S 和 EBP1-His；（B）EBP1 磷酸化分析，检测得到 FER 的磷酸化水平，pSer 和 pThr 抗体用于发现磷酸化 EBP1
3.EBP1对RALF1多肽信号传导产生负向调控作用
基于 fer-4，ebp1，EBP1-GFP 和 EBP1-OE 等基因的突变型和野生型，作者进行了多个 RALF1 多肽反应分析，观察对 RALF1 的敏感性，并通过 qRT-PCR 检测 FER 的相对表达水平。结果说明，EBP1 对 RALF1-FER 信号通路发挥下调作用，对 RALF1 应答产生负向调控作用。
图 | EBP1 抑制 RALF1 多肽应答。不同字母的值之间有显著差异（p < 0.05），采用的检测方法是 ANOVA
4.EBP1 与基因的启动子结合来调控基因表达
作者选取 Col-0 (经 RALF1 处理和未处理)、ebp1-1 和 fer-4 四个组，通过RNA 测序，检测 EBP1 调控基因的表达水平，并用 DAVID 对差异表达基因进行功能注释，发现了与信号转导、转录事件和应激性反应等有关的共有基因，EBP1通过调控这里面的基因作用于 RALF1-FE R信号转导通路。利用 ChIP 实验和 qPCR 分析，得到了 RALF1 处理促进 EBP 1结合的四个基因（CML38、CKX4、ERF1B和SAUR9）。对 CML38 进一步分析，利用电泳迁移率变动分析，证实了 EBP1 蛋白和 CML38 结合的 motif 区域。通过双荧光素酶测定，证明了在 RALF1 信号转导中 EBP1 抑制了 CML38 的 mRNA 的表达水平，从而调控 CML38 的表达。
图 | RALF1-FER-EBP1 信号通路调控基因的表达。（A、B）Venn 图展示了 ebp1-1 和 fer-4 突变体上调和下调的差异表达基因数；（C）Venn 图展示了 EBP1-，FER-和 RALF1 调控基因的总数和共有基因数；（D）ChIP 实验得到了和 EBP1 结合的 CML38 的启动子；（E）竞争性 EMSA 展示了与 EBP1 结合的 “CCACGTC” motif 区域；（F）Dual-LUC 实验证明了 EBP1 抑制了 CML38 的 mRNA 的表达量
总结
RALF1-FER 信号转导提高了 EBP1 蛋白的表达水平，EBP1 在细胞核内积累和磷酸化。EBP1 和 RALF1-FER 调控基因的启动子区域结合，抑制基因的表达，在 RALF1-FER 信号转导中发挥负向调控作用。
参考文献
Li C, Liu X, Qiang X, Li X, Li X, Zhu S, et al. (2018) EBP1 nuclear accumulation negatively feeds back on FERONIA-mediated RALF1 signaling. PLoS Biol 16(10): e2006340. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006340.
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