启因生物热烈祝贺北京大学周菁团队研究microrna分泌发表在美国国家科学院刊PNAS杂志
Zhu J J, Liu Y F, Zhang Y P, et al. VAMP3 and SNAP23 mediate the disturbed flow-induced endothelial microRNA secretion and smooth muscle hyperplasia[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2017, 114(31): 8271-8276.
研究背景
内皮细胞蛋白VAMP3和SNAP23介导血流剪切力调控的microRNA分泌对血管内皮细胞（EC）向平滑肌细胞(SMC)信号传递的机制
方 法
体外流体剪切力加载模型、共培养合并流体加载模型、小鼠血流扰流模型等研究系统，结合胞外miRNA组学方法。透射电镜、miRNA qRT - PCR阵列、RNA分离和qRT - PCR、miRNA原位杂交、瞬时转染和荧光素酶报告试验、免疫沉淀和共免疫沉淀试验、Western印迹试验、免疫荧光、transwell迁移试验。
启因生物主要承担了microrna pcr array的检测，详细描述可以见文章方法附件。
研究结果
图1.
PS（12±4 dynes/ cm2）和OS（0.5±4 dynes/ cm2）6小时，VAMP3和SNAP23的表达和亚细胞定位（A和B）。在B中，白色箭头(上图）表示流动方向，黄色箭头(下图)表示SNAP23定位的质膜。（C）VAMP3和SNAP23在小鼠降主动脉（TA,局部血流大部分为层流)和主动脉弓(AA,局部血流受到干扰)内膜中的表达。（D）通过免疫荧光评估来自TA的直段或AA曲段的内皮中VAMP3和SNAP23的亚细胞定位。
以上结果表明：OS/扰流显着上调了VAMP3和SNAP23的表达并诱导了它们“细胞内 - 表面”的转位。
图2
保护血管的层流和损伤血管的扰流可差异性地调控15个miRNA的分泌（图2A），其中上、下调倍数大于2的miRNA有11个（图2B）。( D和E )用siCL (对照siRNA )或siV + S (靶向vamp 3和snap 23的siRNA )转染ECs，在静态条件下或OS中，miR-126-3p和miR-200a-3p的表达（图2D和E）。
VAMP3和SNAP23介导OS诱导miR-126-3p分泌，miR-126-3p和miR-200a-3p的富集由于VAMP3和SNAP23的消耗而减少。
图3
在A-C，E和F中，将SMC单独培养（EC-）或与ECs（EC +）共培养并用siRNAs（siV + S）和/或miRNA-126-3p模拟物（m126）转染;（A）EC / SMC共培养示意图（左）。分析SMC中miR-126-3p的富集（右）。（B）分析来自A的SMC中平滑肌收缩标志物的表达。（C）transwell迁移测定的示意图（左，下）。通过显微镜观察（上）和量化（右，下）迁移平滑肌细胞。（D）SMC未经处理或用来自经siRNA和/或miRNA模拟物转染的EC的条件培养基处理，并且通过免疫染色Ki67指示细胞增殖。（E）EC-SMC共培养和流动系统的示意图（左）。用免疫荧光法检测SMA的表达和组织（右）。（F）通过免疫荧光测定来自E的SMC中Ki67的表达。
在内皮细胞中敲低VAMP3和SNAP23可抑制扰流对与内皮细胞共培养的平滑肌细胞的增殖、迁移和表型转换的诱导。
图4
（A）用雷帕霉素（Rapa，50nmol / L）或对照载体（DMSO）处理EC ，分析VAMP3和SNAP23的表达。（B）EC用雷帕霉素或DMSO预处理，暴露于PS或OS，分析VAMP3和SNPA23的表达。（C）在用vamp 3或SNAP23的荧光素酶启动子构建体转染的细胞中观察到促动活性的诱导，然后用mTOR活化剂mhy485处理。当转染细胞与雷帕霉素共处理时，这种减少被消除。（D）EC用雷帕霉素或DMSO预处理，保持在静态条件下或暴露于OS，测定EC-CM或流式灌注液中的miR-126-3p积累。（E）单克隆培养(Mono)或与ECs共培养，用雷帕霉素或DMSO处理，检测SMC中miR-126-3p的富集。
雷帕霉素通过抑制VAMP3和SNAP23表达来降低miR-126-3p的内皮分泌和EC-SMC转移。
图5
( A )未结扎或结扎的小鼠颈动脉中免疫荧光染色vamp 3、SNAP23和内皮标记CD31的代表性图像。小鼠接受部分结扎( PL )，并注射雷帕霉素( Rapa )或对照载体。VAMP3、SNAP23和内皮标记物CD31可见。( B ) H & E染色结扎颈动脉的代表性图像和量化。小鼠在手术后立即注射雷帕霉素或对照载体。( C ) miR - 126 - 3p在结扎颈动脉中的原位杂交( D )在结扎颈动脉中的免疫荧光染色SNAP23的代表图像。( E ) H & E染色结扎颈动脉的代表性图像和量化。( F ) 来自E结扎颈动脉中miR - 126 - 3p的原位杂交。
雷帕霉素的全身应用改善了受扰流诱导的新生内膜形成，而Ad - SNAP23的局部递送使其恶化。
mTOR抑制剂Rapamycin能抑制VAMP3与SNAP23在静态和剪切力作用下的生物合成；内皮细胞分泌的miR-126-3p可促进平滑肌细胞增殖和去分化表型、促进小鼠颈总动脉新生内膜增厚，而抑制VAMP3和SNAP23则能将这些改变逆转或减弱。
结果总结
血流剪切力可调节VAMP3和SNAP23的表达；VAMP3和SNAP23调控内皮细胞中miR-126-3p的分泌；内皮细胞分泌的miR-126-3p可促进平滑肌细胞增殖和去分化表型进而形成新内膜。
