性别决定机制是一个层级调控的过程，在不同物种中呈现高度多样性。其中，家蚕作为鳞翅类模式昆虫，其性别决定为WZ型，目前已证实Fem作为一种PIWI-interacting RNA (piRNA)，为鳞翅类昆虫中一类初级性别决定因子，分布于W染色体性别决定区域，通过与PIWI蛋白结合发挥功能。
性别决定机制高度多样化，说明有众多因子参与其中。在小鼠、家蚕、果蝇等物种中，均有研究表明表观修饰（包括组蛋白甲基化）可调控基因的表达从而决定生殖细胞复制、X染色体基因失活、生殖腺分化等，从而决定性别。但在家蚕中，组蛋白甲基化是否参与由piRNA介导的性别决定机制尚未知。
本文通讯作者为中国科学院昆虫发育和进化生物学重点实验室
上海生命科学研究院植生生态研究所谭安江教授
Bombyx mori histone methyltransferase BmAsh2 is essential for silkworm piRNA-mediated sex determination
期刊：PLoS genetics 时间：2018.02
影响影子：6.100
文中mRNA及piRNA测序分析由欧易生物完成
| 研究内容 |
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PIWI蛋白主要在家蚕生殖腺内表达
PIWI蛋白在生殖腺特异性表达这一特性已经在家蚕及其它物种中得到证实。作者利用qRT-PCR技术对两个PIWI蛋白编码基因，BmSiwi（图1.A）和BmAgo3（图1.B）的表达水平进行检测发现PIWI蛋白在生殖腺特异性表达；检测第5龄幼虫 (L5D1) 至成年期（A）期BmSiwi（图1.C）和BmAgo3（图1.D）在生殖腺内的表达水平发现PIWI蛋白在成年期表达水平约提高10倍。此外，作者通过免疫染色技术从翻译水平检测PIWI蛋白在生殖腺中位置（图2），由此推测PIWI蛋白在生殖发生阶段发挥功能。
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BmSiwi和BmAgo3中，只有BmSiwi参与家蚕性别决定
作者利用CRISPR/Cas9系统构建PIWI蛋白突变细胞系，通过组织学分析验证基因敲除效果（图3.A）。通过对Δsiwi 和 Δago3 成熟雌性个体表型分析发现Δsiwi雌性个体卵子形成减少，繁殖能力明显下降并出现部分性别逆转（图3.B、C，图4），表明BmSiwi调控家蚕雌性异型。Bmdsx可变剪切和BmMasc的表达水平是雄性化的两项特征，Δsiwi突变体中，检测到Bmdsx发生可变剪切并且BmMasc的表达水平升高（图5），由此推测BmSiwi通过调控Bmdsx和BmMasc来控制家蚕雌性异型。
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BmSiwi和BmAgo3突变动物模型中piRNAs和TEs发生调节异常
作者通过对突变体幼虫阶段的卵巢组织进行RNA测序分析，与WT相比，Δsiwi突变个体中差异基因数远高于Δago3突变个体，都有差异基因富集到GO条目“reproduction”和“reproduction process”中，证明BmPIWIs参与卵子形成（图6.A、B、C）。
此外，通过构建smallRNA文库对piRNA进行测序分析，与WT比较，突变个体中长度28nt,29nt and 30nt的piRNAs丰度均有所下降（图6. D）。
利用qRT-PCR检测6种已知piRNA及7种TEs在Δsiwi和Δago突变个体卵巢组织中表达水平，piRNA表达水平下降（图7.A），推测这些piRNA与BmSiwi结合。此外，在Δsiwi雌性个体中，TEs表达水平上调（图7.B），可能由于其所受抑制减弱。
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HMT BmAsh2参与家蚕性别决定
结合RNA-seq及q RT-PCR结果发现，与WT相比，Δsiwi雌性突变个体中，三种组蛋白甲基转移酶（HMT）BmAsh2, BmSETD2 和BmEggless表达水平有不同程度的下降（图6. E）。利用CRISPR/Cas9 系统分别构建三种HMTs突变模型，结果发现Δash2和Δsetd2动物模型在翅膀形态异常，与Δsiwi和Δago3个体相似，雌性突变体表现出卵子形成异常（图3），当中只有Δash2与Δsiwi突变个体一样，表现出部分性逆转的特征（图4），在Δash2突变体中检测到Bmdsx发生可变剪切并且BmMasc的表达水平升高（图5）。综上证明，三种HMTs中，只有BmAsh2参与家蚕性别决定。
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BmAsh2作为BmSiwi的协同因子起作用
利用qRT-PCR检测6种已知piRNA及7种TEs在Δash2 和Δsetd2动物模型卵巢组织中表达水平（图7.C、D），推测BmAsh2与BmSETD2的调控都依赖piRNA。通过免疫染色可看到，BmAsh2分布位置与BmSiwi相似（图2.A）。通过免疫实验检测到Δash2突变体卵巢中组蛋白甲基化水平降低（图8.A）。通过Western blotting检测到Δsiwi 卵巢中BmAsh2蛋白水平降低，但在Δash2突变体卵巢中，BmSiwi转录水平及蛋白水平没有明显差异（图8.C）。推测在性别决定通路中，BmAsh2并不作用于BmSiwi上游。通过免疫沉淀实验证明BmAsh2与BmSiwi直接互作（图8.D）。由此证明在性别决定过程中，BmAsh2由BmSiwi及piRNA介导起功能，并预测出家蚕性别决定分子机制（图9）。
图8. 免疫染色及免疫沉淀实验
参考文献
Li Z, You L, Yan D, et al. Bombyx mori histone methyltransferase BmAsh2 is essential for silkworm piRNA-mediated sex determination[J]. PLoS genetics, 2018, 14(2):e1007245.
原文链接
https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1007245
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