骨骼是脊椎动物内的坚硬器官，具有保护、支持、造血、储存和运动的功能，骨骼的发育至关人体的身心健康。骨骼的发育是极其复杂的一个过程，具有众多调控因子参与其中。目前，已有大量研究表明，有一种转录因子—Runx2，就参与到骨骼的发育过程中，它在肥大软骨细胞中表达活跃，并在软骨细胞发育为成骨的过程中发挥着至关重要的作用。Runx2基因沉默的小鼠体内明显缺乏矿物丰富的组织，并且骨骼的生长发育明显受到阻碍。在人体中，Runx2的表达异常，会致颅骨锁骨发育不良。为了探寻和Runx2共同发挥作用的互作蛋白，有篇文章采用酵母双杂交的技术来寻求答案，并最终获得与Runx2互作的蛋白。
- 1 -
作者首先在NCBI上找到小鼠Runx2基因的序列信息。它共计9个外显子，编码区在第2到第9个外显子上，随后作者把ORF区域构建到pGBKT7载体上。
A：Runx2基因外显子信息；B：pGBKT7-Runx2载体的构建
为了证实构建的pGBKT7-Runx2载体可以正常表达，并且不会对酵母的生长产生毒性影响，作者将其转化进酵母，在SD/-Trp的平板上进行涂板验证。发现酵母生长正常，即表示载体构建成功。
- 2 -
随后作者对库质粒cDNA进行LD-PCR检测（所用引物为特殊的随机引物—CDSIII/6），共计两种cDNA，来源于肥大区域软骨细胞及MCT细胞的总RNA反转录。结果显示，大部分PCR产物在500bp附近。然后将这些文库质粒同pGBKT7-Runx2载体进行共转，筛选出在SD/-Leu-His-Trp-Ade/ABA/X-ɑgal平板上生长的阳性克隆。
A：LD-PCR结果；B：Prey载体与Bait载体进行共转；C：筛选得到的阳性克隆
抽提阳性克隆的质粒，通过ADLD-PCR检测插入片段的大小，并将PCR产物纯化，然后进行测序，获得其序列信息。通过对比NCBI/GenBank数据库的信息，作者筛选出几个潜在的转录因子，包括Col1a2, Edf1(Endothelial differentiation factor), Lgals1 (Lectin, galactose binding, soluble 1-1), and Timp-2。随后作者在GenePaint上寻求这些基因的表达情况，并和肥大软骨细胞特异表达基因—Col10a1进行对比，发现这些基因表达均不相同，Col10a1作为阳性对照表达最强，Lgals1表达较强，Col10a2表达较弱，而Edf1表达最弱。
GenePaint数据库上显示的不同候选基因表达情况
- 3 -
最后，作者通过RNA半定量和定量（qRT-PCR）的实验检测在增殖的MCT细胞和肥大的MCT细胞中这些候选基因的表达情况，发现阳性对照Col10a1在两种类型的MCT细胞中表达差异最大，Timp-2和Lgals1也存在明显的表达差异，但Timp-2的差异更为明显。
A：候选基因表达半定量结果；
B：候选基因表达定量结果（32℃：MCT细胞处于增殖状态；37℃：MCT细胞处于肥大状态）
作者通过酵母双杂交的技术筛选到与Runx2互作的蛋白Timp-2，并且其表达情况与阳性对照Col10a1的表达情况最为类似，故作者得出结论，Timp-2蛋白可能与Runx2一起参与到骨骼发育过程中，为骨骼发育的机制做出了进一步的阐释。
- 参考文献 -
YFeifei Li, Rui Mi, Chuling Fan, Ping Zhang ,et al. Runx2-interacting genes identified by yeast two-hybrid screening of libraries generated from hypertrophic chondrocytes. Am J Transl Res 2016;8(12):5465-5474
