目睹细胞“趋化运动”的全过程

2018-01-19 11:46 · tekon

与传统的“Boyden chamber transwells”和“microfluidic devices”相比,IncuCyte“趋化运动”解决方案具有明显的优势,适合各种“趋化运动”实验。

一、 什么是“趋化运动”

 

“趋化运动(Chemotaxis)”是细胞在化学物质刺激(趋化因子)下进行的定向运动,包括“趋化迁移(Chemotactic migration)”和“趋化侵袭(Chemotactic invasion)”,是免疫响应、细胞分化、肿瘤转移、伤口愈合和血管形成等生理现象的重要组成部分。研究细胞的“趋化运动”对进一步理解上述生物过程十分关键。

 

二、 传统研究方法的缺陷

 

传统“趋化运动”研究利用“Boyden chamber”进行,在趋化的终点进行成像计数观察。“Boyden chamber”虽然能研究细胞对趋化因子的反应,但它有明显的缺陷:无法获得细胞进行迁移和侵袭的动态图像、需要大量的细胞(50,000 ~ 100,000细胞/孔),最关键的是只能采取“终点法”进行观察,而细胞“趋化运动”的动态过程随着细胞种类和趋化因子不同而有很大的差异,“终点法”完全无法区分不同的动态过程。

 

三、 Essen的“ClearView趋化微孔板”

 

Essen BioScience开发了创新性的技术,可以进行动态的、基于图像的、高通量的96孔“趋化运动” 研究。该技术利用含有光学透明膜的“ClearView96孔趋化微孔板”作为耗材,可以在“IncuCyte活细胞动态成像与分析系统”内对“趋化运动”全过程进行全自动的动态成像。在此过程中,可保证细胞一直维持在标准培养箱内的生理环境中。

 

 

图1.“趋化运动”专用的“ClearView 96孔趋化微孔板”。该板由三部分组成:上层为透明盖,中层为种植细胞的96孔板,下层为透明试剂槽。中层的96孔板上,每个孔中都有光学透明的膜,上面用激光打出很多直径为8µm的精确的小孔。实验时,细胞种入中层板孔中的膜上,趋化因子(Chemoattractant)注入下层的试剂槽中。然后放入“IncuCyte活细胞动态成像与分析系统”动态记录细胞在趋化因子作用下穿过小孔的运动。

 

四、 如何定量“趋化运动”?

 

在用户定义的时间间隔对“ClearView趋化微孔板”中层膜的上表面和下表面进行全孔成像,用自动的算法对上下表面的细胞面积进行定量(图2)。对于贴壁细胞,可以计算膜的下表面的细胞面积的增加;对于悬浮细胞,可以计算膜的上表面的细胞面积的减少,这时细胞穿过膜上的小孔掉到膜的下方。

 

 

图2.“趋化运动”的无标记分析。HT-1080纤维肉瘤细胞的接种密度是1,000细胞/孔。下层试剂槽中的“趋化因子”是10% FBS。左侧图是36小时的膜的上表面(细胞用黄色勾出);中间图是36小时的膜的下表面(细胞用蓝色勾出),右侧图是上下表面的合成图。橘红色表示膜上的小孔。

 

五、IncuCyte“趋化运动”解决方案的优势

 

IncuCyte“趋化运动”解决方案与传统的“Boyden chamber transwells”和“microfluidic devices”相比有很多明显的优势,如:

(1)将动态的细胞迁移/侵袭过程可视化,输出动态影像,观察细胞形态;

(2)培养箱内的长时间自动化分析,保留细胞生长状态,节省人力,并输出迁移/侵袭的动态曲线

(3)高度可重复的96孔动态实验,适合进行筛选;

(4)可做贴壁细胞,也可做悬浮细胞;

(5)细胞可以单独培养也可以共培养;

(6)兼容无标记分析荧光标记分析

(7)细胞用量低,适合用于珍稀细胞、昂贵细胞或原代细胞群。ClearView板每孔需要的细胞数目是1,000-5,000个/孔,而“Boyden chamber”方法每孔需要的细胞数目最少50,000个/孔;

(8)孔的密度更小,细胞需要在膜的表面运动,是表面介导的迁移/侵袭过程,可表现膜表面的基质性能和更深入的表型特征;

(9)能更长时间维持膜两侧的趋化因子的浓度梯度,ClearView方法维持浓度梯度超过72h,而“Boyden chamber”方法4h后可观察到明显的浓度梯度下降。

 

六、IncuCyte“趋化运动”解决方案的特点

 

 

图3. 实时96孔“趋化运动”的图像和数据分析。A图:IncuCyte ClearView 96孔板上的T细胞的高清晰度相差图像。B图:T细胞对不同浓度的趋化因子CXCL11和SDF-1α的96孔板曲线。C图:T细胞对不同浓度的趋化因子SDF-1α的剂量响应曲线,纵坐标是板上层的细胞面积。可见浓度越大,曲线下降越快,说明上层细胞快速穿过小孔。D图:对剂量响应曲线在30h的数据点做图,得到上层T细胞面积对SDF-1α浓度的对数值的曲线。

 

 

图4. 96孔的“趋化运动”曲线显示极佳的板间重复性。三天内四块微孔板的Z’值为0.5-0.7,相应的对趋化因子SDF-1α的浓度响应曲线显示了对SDF-1α响应的重复性(EC50为19-33nM)。

 

图5. 检测“表面基质”介导的细胞迁移。ClearView板的孔密度很低,嗜中性粒细胞要向趋化因子方向运动就必须在膜表面进行迁移。左图:ClearView板的膜未进行包被,细胞不发生迁移,此时趋化因子为:IL-8和fMLP。右图:膜表面被Matrigel包被,细胞有明显的趋化运动。该数据显示:整合素(integrin)和/或细胞表面受体与基质的相互作用是该模型中嗜中性粒细胞趋化运动的关键。相反,在“Boyden chamber transwells”中做嗜中性粒细胞的趋化实验时,则不需要进行包被(数据未显示)。

 

七、“趋化运动”分类

 

“趋化运动”可分为(1)穿过基质表面的“趋化迁移”;(2)穿过3D生物基质胶“趋化侵袭”和(3)白细胞的穿内皮“趋化迁移”。

 

7.1穿过基质表面的“趋化迁移”


 

图6.穿过基质表面的“趋化迁移”

 

特征:

(1)可动态监控和定量细胞穿过塑料板或生物基质包被的定向的细胞迁移;

(2)适用于广泛的免疫、肿瘤和血管细胞类型;

(3)可研究不同处理方法对“趋化迁移”的全时程的影响。

 

7.2 穿过3D生物基质胶的“趋化侵袭”


 

图7. 穿过3D生物基质胶的“趋化侵袭”

 

特征:

(1)可动态成像和定量细胞穿过3D生物基质胶的“趋化侵袭”,比如“肿瘤侵袭”

(2)可评估转移的潜能并定义处理方法对侵袭表型的影响;

(3)可在同一块微孔板上探索不同的“趋化迁移”和“趋化侵袭”的生物过程。

 

7.3 白细胞的穿内皮的“趋化迁移”


 

图8.白细胞的穿内皮的“趋化迁移”

 

特征:

(1)监控和定量动态的白细胞穿过内皮单层的定向迁移;

(2)对内皮单层的完整性和白细胞渗出进行可视化;

(3)探索抑制剂和中和抗体的生物学作用。

 

八、总结

 

与传统的“Boyden chamber transwells”和“microfluidic devices”相比,IncuCyte“趋化运动”解决方案具有明显的优势,适合各种“趋化运动”实验。

 

九、自动化的活细胞动态分析   

 

目前,大部分的细胞检测方法仍然属于传统的终点法——仅仅给出最终结果,这种方法不仅无法对细胞实验的全过程做出动态的监测和分析,还可能得到有偏差的结果。为了能够全程的观测活细胞,美国Essen公司开发了内置于培养箱的IncuCyte S3“活细胞动态成像与分析系统”,在培养箱内部,同时对6块细胞培养皿/瓶/微孔板(6-384孔)进行长时间的动态成像,记录细胞形态细节的实时改变,并通过功能强大的图像分析软件转化为多种细胞功能相关的时间定量曲线。

 

IncuCyte S3是细胞水平的科研与药物筛选解决方案,已用于免疫肿瘤杀伤、神经生长及退行、癌细胞转移、细胞迁移、干细胞分化、细胞凋亡、细胞坏死、细胞增殖、伤口修复等应用的大规模筛选与长时程生命科学问题的研究。

 

图9. IncuCyte S3活细胞动态成像与分析系统

 

 

十、关于“典奥生物科技”   

 

“典奥生物科技”(上海、香港、台湾)成立于1994年,二十多年来一直坚持以国际一流仪器生产商为背景,具有丰富研发经验的专家为技术支持,专业的维修团队为服务后盾,专注于为生命科学、医药研发和疾病治疗领域,提供最先进的软硬件设备和技术服务。

 

“典奥生物科技”独家总代理的仪器有:

IncuCyte、Beacon、Chipcytometry、Gyrolab、iQue Screener PLUS、Avatar、PlexBio、Certus、HighRes等。

 

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