96孔的细胞划痕实验还可以这么轻松？
上海典奥生物科技有限公司
细胞划痕实验：经典不代表没有痛点
细胞迁移与侵袭是研究肿瘤转移、胚胎发育、伤口愈合、炎症等生命功能的基础。然而，传统的方式很难系统地对比不同实验条件对细胞迁移的影响。划痕实验虽然常用，但由于划痕的宽度、方向、位置难以保持一致，且繁琐的操作导致通量难以提升，所以很难进行科学并稳健的实验分析。
此外，细胞迁移是一个长期动态的过程，但目前大部分的细胞检测仍然采用终点法 ，只能看到的只是某个实验的瞬间，而不是整个实验的趋势。
那么问题来了，我们怎样才能做出高一致性、高通量、长期动态的划痕实验呢？
IncuCyte®的解决方案
图1：IncuCyte ® 系统镜头下的3D细胞侵袭实验
侵袭性的HT-1080细胞与无侵袭性的MCF-7细胞
针对以上问题，美国Essen公司围绕IncuCyte ®实时活细胞分析系统的开发了细胞迁移&侵袭应用。其中，配套的96孔划痕利器（WoundMakerTM）能够形同时成96条高度一致的划痕，极大地提升了实验结果的稳健性，并解除手动划痕的艰辛劳动。
96孔划痕器的上盘装有96个划痕小针，按一下的黑色按钮可使上盘向侧面移动。上盘移动的同时，划痕小针会在96孔培养板的每一个孔同时划出96条宽度相等、笔直的划痕！
图2：手动划痕（右上）与96孔划痕器 （右下） 的效果对比
在96孔板中加入不同的实验条件后，放入培养箱内置的IncuCyte®系统，对划痕愈合的动态过程进行长时间的实时监控。IncuCyte® 可同时容纳6块96与384孔板，通过功能强大的图形分析软件，对每个孔的迁移过程进行定量分析。在数据采集的过程中，细胞无需离开稳定的培养箱环境，用户也无需要反复出入细胞房。
图3：培养箱内置的IncuCyte®系统（左）和96孔划痕愈合的实时曲线图（右）
长时间动态的活细胞分析有多重要？
细胞迁移的过程分许多步骤，并受到多种信号通路（signaling pathway）的调控。IncuCyte®的高通量、高一致性、长时间实时检测让用户能够同时研究多种药物的时间-剂量作用。当Trezise博士团队通过4种不同的途径抑制细胞迁移（肌动蛋白聚合、mTOR、Hsp90、PI3-激酶），并用IncuCyte®进行40小时的实时分析后，发现虽然4种方式都能放缓划痕愈合的效率，但每种药物起最大作用的时间却是不同的。
比如，PI3K抑制剂【Wortmannin，右下】的作用在前期最为明显，这与PI3K信号通路调控细胞迁移的前期步骤：细胞极性形成和头部伪足的延伸相辅。而Hsp90抑制剂【CCT018159，左下】则在后期中止了划痕愈合的进程。如果没有长时间的实时观测，则很难发现这种时间效应上的不同。
图4：IncuCyte®观测下的40小时实时划痕愈合，可同时研究多种药物的 时间-剂量作用
（RWD%= 划痕区细胞相对密度）
除了量化数据，IncuCyte还保存了划痕愈合过程的实时图像记录。我们同样能够看到，在相同的浓度下，Wortmannin与CCT018159作用在时间上不同。在前期（t=6h）Wortmannin对细胞迁移的抑制作用要强于CCT018159（划痕更宽），但是到了后期（t=12h, t=24h）CCT018159却中止了划痕愈合的进程。
同样的实验，我们在 t=6h 看到的结果与 t=24h 是相反的。如果我们采用终点法的检测，只在某些特定的时间点来观察结果，我们不仅无法得到全面的信息，还可能因为时间点挑选的不同而得到相悖的结果。
图5：从划痕愈合的实时记录中，挑选出 t=0, 6h, 12h, 24h 的图像结果
由于IncuCyte可以同时分析6个微孔板，我们可以大规模筛选调控细胞迁移的各种因素，比如小分子、生物药、RNA干扰等。Trezise博士对2种细胞系（3T3，HT1080），对每3种信号通路（PI3K、mTOR、Hsp90）加入3种不同的抑制剂进行筛选。发现3T3细胞的迁移能力对对PI3K抑制剂更加敏感。
图6：基于细胞划痕实验的高通量筛选
IncuCyte®系统：其他应用
细胞迁移/侵袭是炎症、创伤愈合和肿瘤发育等生理和病理过程的关键事件，美国Essen公司已把划痕愈合检测发展成了高通量、稳健、简单、基于长时间动态图像分析的方式，可用于大规模的筛选。
而IncuCyte®作为在全球贡献超过1000篇文献的仪器，其应用还有很多，包括免疫细胞杀伤、Chemotaxis 趋化性迁移、细胞吞噬等等，我们会下次带您继续解析。
图7：IncuCyte的关键应用
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参考：
O’Callaghan T, Alcantara LS, Dale TJ, NelsonT, Riggs AJ, Neagle B, Groppi V, Trezise DJ. (2011, September). High-fidelity_96well_kinetic_imaging_assays_for_cell_migration. Poster session presented atthe MipTec 20: European Conference and Exhibition for DrugDiscovery at Basel, Switzerland.
