一、原代培养
从原代组织中分离细胞的最常用的方法是酶解法（胰蛋白酶和胶原酶）。
用无菌的解剖刀和剪子将组织剪成3~4mm小片，用平衡液（无钙镁离子）清洗组织碎片后去除上清液，并加入0.25%的胰蛋白酶（Trypsin，100mg组织加入1ml胰蛋白酶）或者胶原酶（Collagenase，50~200单位/ml），孵育4-18h。离心取上清后，用平衡液清洗几次后，用完全培养基悬浮细胞，进行培养。
二、传代培养
依据细胞生长的特点，传代方法有3种：
1. 悬浮生长细胞传代（离心法）
将悬浮细胞离心（1000 rpm， 3 min）去上清，收集沉淀物加新培养基，混匀后进行传代培养。
2. 半悬浮生长细胞传代（直接吹打法）
此类细胞（如Hela细胞）部分贴壁，但黏贴不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁上脱落下来，进行传代。
3. 贴壁生长细胞传代（酶消化法）
去除瓶内培养液后，加入1-2ml 0.25%的胰蛋白酶液（以消化液覆盖整个瓶底为准）37℃静置2-10min（显微镜下动态监测）。移去蛋白酶液，加入培养液反复吹打瓶壁细胞，离心将细胞沉淀用培养液制成细胞悬液。吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于含有适量新鲜培养液的新培养瓶中进行传代培养。
说
明细胞接种数要达到5×104~8×105个/ml，传代密度太低时，细胞容易死亡，在达到增殖期前有较长的滞留期；培养液由pH下降而呈黄色时，细胞已达最大密度而需要换液或传代；单层贴壁细胞，等长满培养瓶表面时，即可传代；吹打细胞时，动作要轻柔缓慢，减少对细胞的机械损伤；传代时细胞接种数量要多；培养基的pH要低些；首次传代时，小牛血清浓度可加大至15%~20%。
三、细胞计数
一般条件下具有一定密度的细胞才能生长良好，所以细胞计数对细胞培养也非常重要。计数结果以每毫升细胞数表示。可分为两种计数方法：血细胞计数器（手动计数）和Coulter计数仪（自动计数）。
细胞计数步骤
1 将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。
2 将细胞悬液吸取少许，滴在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置2min,镜下观察，计算计数板中四大格的细胞总数。
细胞数/ml=4大格细胞总数/4×104
说明
压线细胞只计左侧和上方的。镜下偶见由两个以上的细胞组成的细胞团，应按单个细胞来计数，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
四、细胞冻存与复苏
考虑到培养细胞因传代而迟早出现变异，同时也为了避免长期培养中细胞遭到污染。要对细胞进行冷冻保存。细胞冻存及复苏的基本原则就是慢冻快融，尽量减少胞内水分子形成冰晶，最大限度保存细胞活力。细胞中常用的冻存保护剂是DMSO或者甘油。
冻存：1）将预先配制好的冻存液（20%血清培养基+10%DMSO）与制备的细胞悬液（1×106~1×107/ml）以1:1的体积混匀，1ml分装于冻存管中，密封后标记。2）冻存方法：先将冻存管放入4℃冰箱，约30min；置于-20℃冰箱，约30-60min；然后有三种方法保存，择一即可：1、置于-80℃冰箱过夜，置于液氮罐中长期保存。2、将冻存管捆绑在一起，外层包以厚层棉花，置于-80℃冰箱过夜，置于液氮罐中长期保存。3、将冻存管放于程序降温盒中，并置于-80℃冰箱过夜，置于液氮罐中长期保存。
复苏：1）取出冻存管，立即放入37度水浴箱中快速解冻（1分钟左右），水面不可没过盖子，以避免污染。2）将冻存管移至无菌操作内。打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中，1000rpm, 5min，弃上清。3）加入适量完全培养基，置于37度恒温箱中培养即可。
说明
注意事项：由-80冰箱转移到液氮时速度要快，避免温度上升影响细胞活性。
五、细胞活力鉴定
细胞活力=活细胞数/细胞总数×100%，常用台盼蓝法、MTT法或者CFSE法进行细胞活力检测。
1、台盼蓝法
原理：活细胞不被染色，死细胞被染成蓝色。
方法：500ul细胞悬液加入500ul 0.4%台盼蓝染液，染色2-3分钟；将少许悬液涂于载玻片上，加上盖片，显微镜下取几个任意视野分别统计死细胞和活细胞数，计算细胞活力。
2、MTT法
原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可使外源性MTT分解产生水不溶性蓝色结晶状甲瓒颗粒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO溶解甲瓒后，用酶联免疫检测仪在540nm或720nm波长处测定其吸收值，可间接反映活细胞数量。可用于生物活性因子的活性检测、大规模的药物筛选、细胞毒性试验鉴定等。
方法：将细胞悬浮液以1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul，培养细胞3-5d（依据实验目的和要求决定培养时间）后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4）20ul，37℃温箱中孵育4h后，小心去上清，加入150ul DMSO溶解后，用酶标仪进行检测。（市场上售卖的CCK8试剂盒，便是对MTT法的一种优化）。
3、CFSE法
原理：CFSE进入活细胞后，可与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。CFSE随着细胞分裂而平均分配至子代细胞中，而导致荧光强度逐级递减，依据这一特性，可被用于检测细胞增殖活力。
方法：制备细胞悬液后，加入等体积的CFSE工作液（2.5-5uM），于37℃孵育10 min，用10倍体积的预冷的基础培养基（不加血清）立即终止标记10min。用PBS离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细胞。培养一段时间后，离心收细胞，用PBS洗两次并重悬后，上流式仪器检测荧光强度的稀释比例。
六、细胞周期检测
细胞周期是指细胞从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为时间，反应了细胞增殖速度。可分为四个阶段：1）G1期（gap1），指从有丝分裂完成到DNA复制之前的间隙时间，此时细胞开始RNA和蛋白质合成，但DNA含量仍保持二倍体；2）S期（synthesisphase），指DNA复制时期，指DNA复制期，DNA含量介于G1期和G2期。3）G2期（gap2），指DNA复制完成到有丝分裂开始前的一段时间，DNA含量为四倍体，继续合成RNA及蛋白质为有丝分裂做准备。4）M期（mitosis）指细胞分裂开始到结束。细胞从M期进入到G1期的时间则是细胞静止期（G0期）。
原理
一般是通过核酸染料（如PI、Brdu）标记DNA，并用流式细胞仪进行检测，可得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1，S及G2/M的百分含量，了解细胞增殖能力。
方
法
悬浮细胞液在离心去上清后，用预冷PBS洗两次，3ml/次，弃上清后加入3ml预冷的70%乙醇到细胞沉淀中，于4度固定过夜。离心收细胞，并以3ml的PBS洗两次，加入500ul PBS（含有50ug/ml PI），100ug/ml RNase，0.2% Triton X-100,4度避光孵育30min,上机检测
七、细胞凋亡检测
细胞凋亡指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡。实验中一般采用以下三种细胞染色方法检测细胞凋亡。
1、AnnexinV/PI双染法
原理：有荧光素的Annexin V对细胞膜的磷脂酰丝氨酸（PS）具有高亲和力。PS在细胞凋亡早期时可由膜内转移至膜外。PI是一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但在凋亡晚期和死细胞中，PI可透过细胞膜而染红细胞核。该方法可区分凋亡早、晚期细胞及死细胞。
方法：1)悬浮细胞用PBS洗两次后，加入荧光素标记的Annexin（20ug/ml）10ul，室温避光30min。2)再加入PI（50ug/ml）5ul,避光5min，用PBS重悬后在1h内进行流式检测。
结果分析：正常细胞Annexin、PI均低染；凋亡细胞Annexin高染、PI低染；坏死细胞Annexin、PI均高染。
2、线粒体膜势能检测法
原理：细胞凋亡刺激因子可使细胞线粒体跨膜电位DYmt的下降；而DYmt的崩溃，使细胞凋亡不可逆转。DYmt的存在使一些亲脂性阳离子荧光染如Rhodamine123、DiOC6、JC-1、TMRM等结合到线粒体基质，其荧光强弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
方法：悬浮细胞用PBS洗两次后，加入使用终浓度为Rhodamine123(1mM)/DiOC6(25nM)/JC-1(1mM)/TMRM（100nM）,37℃平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。
结果分析：正常细胞荧光强度强；凋亡细胞荧光强度弱
3、TUNEL技术
原理：细胞凋亡时，DNA双链断裂或单链断裂而暴露的3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸转移酶（TdT）的作用下，加上荧光素标记的dUTP，从而通过流式细胞仪检测凋亡细胞。
方法：1)收集细胞，用PBS洗一次，用4%多聚甲醛固定细胞30-60min,2)用PBS洗涤一次后，加入含有0.1%TritonX-100的PBS,冰浴2min,3)PBS洗两次后，加入50ulTUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。4)用PBS洗涤并悬浮，上流式仪器进行检测。
结果分析：正常细胞荧光强度低，凋亡细胞荧光强度高
八、细胞培养的疑难杂症
细胞培养质量的好坏，直接关系到实验进行的顺利与否。而细胞污染多半是由无菌操作技术不当、器皿试剂灭菌不彻底、手或器械从打开的器皿口上方经过等造成的。且细胞一旦被污染，多数是无法挽回的。也许有些细胞在污染早期，如果能及时去除污染物，部分细胞有可能恢复，但是当污染物持续存在培养环境中，极大程度会导致培养细胞死亡。因此，处理细胞污染的原则就是预防为主，一旦污染，果断扔掉。
