单纯性马蹄内翻足(Idiopathic congenital talipes equinovarus, ICTEV)是常见的严重危害儿童健康的先天畸形之一，为了探讨人类GLI3基因在ICTEV发生时所起的作用，来自中国医科大学基础医学院医学遗传学教研室，中国人民解放军202医院的研究人员通过构建荧光素酶报告基因表达载体等实验手段，证明了大鼠的转录因子En1可能是Gli3基因的上游负调控元件，从而为ICTEV的研究，以及相关的靶向治疗提供了理论依据。
单纯性马蹄内翻足(idiopathic congenital talipes equinovarus，ICTEV)是常见的严重危害儿童健康的先天畸形之一，主要表现为足前端内收，踝跖屈，跟骨内翻，胫骨远侧内旋等改变，发病率约为活婴的1～8‰，ICTEV的病因是未知的，临床资料和流行病学研究表明，ICTEV主要是由于胚胎期遗传因素和环境因素共同作用，从而导致肢体发育异常。
GLI3是参与早期肢体发育的重要转录因子之一,已证实与指(趾)的发育密切相关,但是否与ICTEV的发生相关国内外未见报道。在这篇文章中，研究人员前期以ICTEV核心家系为研究对象，通过SNP关联分析的方法发现GLI3基因与ICTEV的发生可能相关。之前有科学家报道EN1基因的突变也会造成指的结构发生变化,而这两个基因同在极化活性区(Zone ofpolarizing activity,ZPA)表达。为了探讨这两个基因之间是否相互作用,以及二者的相互作用是否与ICTEV的发生相关,研究人员构建了大鼠ICTEV动物模型,对大鼠En1表达水平和Gli3调控机制进行了研究。
研究的整体思路是，研究人员首先构建了大鼠Gli3基因启动子区域荧光素酶报告基因表达载体来分析Gli3基因启动子的活性,并利用P-Match软件预测大鼠Gli3基因启动子区域可能的调控元件,应用ChIP实验加以验证。并利用RT-PCR、免疫组化和Western blotting的方法分析大鼠En1与ICTEV的相关性。经P-Match软件预测,Gli3基因启动子区域有３个转录因子En1的可能结合位点,经ChIP实验证实位点1是真正结合位点。RT-PCR、免疫组化和Western blotting方法都证实En1基因在马蹄内翻足模型鼠中表达下降。
实验结果表示大鼠的转录因子En1可能是Gli3基因的上游负调控元件。在ICTEV患者中,很可能是由于EN1基因表达水平的下降导致了GLI3基因表达水平的上升,最终导致ICTEV的发生。这一对大鼠En1表达水平和Gli3调控机制进行的研究，为ICTEV的发病机制和病因学研究奠定基础。
目前虽然对ICTEV的遗传因素的作用比较肯定,但其致病基因的鉴定却进展缓慢。人类胚胎在孕12周时已能通过超声检查识别出ICTEV症状。其致病基因必然是在此之前就发生异常表达,并与骨骼、软骨、肌肉、神经的发育相关,特别是与足踝部发育相关。已知的与下肢发育相关的基因有DTDST、COL9A1、FGF、SHH、WNT、EN-1、LMX-1、GLI1、GLI3、HOXD、BMP等,可以通过对ICTEV致病基因的定位及功能鉴定对其发生做进一步的研究。
在肢体发育的早期,肢体远端沿前后轴的发育主要是受其后端间充质内ZPA的调控。而转录因子GLI3是该区域内的信号分子之一,它可以沿肢体前后轴方向限定各个基因表达的区域边界,这为建立肢体不对称模式提供了必要的位置信息[12]。目前的研究认为,GLI3作为SHH-GLI3信号通路中的关键环节来发挥作用。在肢体发育的过程中,GLI3基因能确定指(趾)的数目。至今已有很多报道表明,GLI3基因突变可导致多种先天畸形,而这些综合征均表现有肢体特别是指(趾)的数目及形态畸形。如Greigs综合征和Pallister-Hall综合征等, 二者的相关基因都被定位于7p13,随后又都被证实与GLI3 基因相关。
这项研究通过对En1基因在ICTEV模型胎鼠下肢的表达情况进行分析,证实En1基因通过调控Gli3基因的表达参与ICTEV的发生。但ICTEV的发生很可能与多个基因相关,这些基因之间是否相互作用、相互影响,是否存在一个影响肢体发育的网络还有待于深入研究。
推荐原始出处：
BMC Musculoskeletal Disorders 2009, 10:142doi:10.1186/1471-2474-10-142
The expression of Gli3, regulated by HOXD13, may play a role in idiopathic congenital talipes equinovarus
DongHua Cao1,2 , ChunLian Jin1 , MeiHong Ren1 , ChangKun Lin1 , Xuan Zhang1 and Ning Zhao1
1 Department of Medical Genetics, China Medical University, Shenyang, 110001, PR China
2 Department of Test, No.202 hospital of People's Liberation Army, Shenyang, 110003, PR China
Background
Idiopathic congenital talipes equinovarus (ICTEV) is a congenital limb deformity. Based on extended transmission disequilibrium testing, Gli-Kruppel family member 3 (Gli3) has been identified as a candidate gene for ICTEV. Here, we verify the role of Gli3 in ICTEV development.
Methods
Using the rat ICTEV model, we analyzed the differences in Gli3 expression levels between model rats and normal control rats. We used luciferase reporter gene assays and ChIP/EMSA assays to analyze the regulatory elements of Gli3.
Results
Gli3 showed higher expression levels in ICTEV model rats compared to controls (P & 0.05). We identified repressor and activator regions in the rat Gli3 promoter. The Gli3 promoter also contains two putative Hoxd13 binding sites. Using EMSA, the Hoxd13 binding site 2 was found to directly interact with Hoxd13 in vitro. ChIP assays of the Hoxd13-Gli3 promoter complex from a developing limb confirmed that endogenous Hoxd13 interacts with this region in vivo.
Conclusion
Our findings suggest that HoxD13 directly interacts with the promoter of Gli3. The increase of Gli3 expression in ICTEV model animal might result from the low expression of HoxD13.
