近日，美国St.Jude儿童医院免疫学系著名免疫学家Douglas R.Green在免疫学期刊Immunity发表评论文章，讨论了时下热门的CRISPR-Cas9技术在研究小鼠免疫学功能方面的应用，并对应用该技术解决免疫学难题提出了一些参考建议 。
Douglas R.Green在该评论文章中提到，基因修饰小鼠的应用为阐述免疫系统构成和功能提供了巨大帮助，在过去三十年中，应用同源重组技术进行胚胎干细胞基因打靶成为构建基因修饰小鼠的主要手段，但这种方法存在诸多缺陷，因此又发展了如TALEN以及CRISPR-Cas9等新技术。
相比于ZFN和TALEN技术的操作复杂性，cas9只需依靠人工合成的sgRNA即可发挥作用，因此CRISPR-Cas9技术正快速成为基因打靶的主要方法。Douglas R.Green提到，虽然应用CRISPR-Cas9需要基因组序列中存在PAM序列可能被视作该技术应用的限制条件，但目前已发现cas9 PAM序列在基因组中平均每十个核苷酸就会出现一次，再加上在更多物种中发现的不同CRISPR-Cas均已被开发为基因修饰工具，该系统可得到更加广泛的应用。
Douglas R.Green同时还指出，应用CRISPR-Cas9系统也存在诸多限制。首先，必须警惕CRISPR-Cas9可能存在的脱靶效应，已经有研究发现cas9可能会容许crRNA与靶标序列之间存在错配现象。虽然对cas9的特异性还没有一个明确的规定，但错配出现的数量和位置仍然可能会对基因修饰的特异性起到至关重要的作用。除此之外，虽然CRISPR-Cas9技术能够同时靶标几个位点，包括同一个基因的两个等位基因，但当靶标基因对胚胎及生殖细胞发育起重要作用时，CRISPR-Cas9的应用就会受到限制。
Douglas R.Green还在该评论中列举了一些在CRISPR-Cas9技术在免疫研究中应用的实例。
综上所述，Douglas R.Green教授在这篇评论中讨论了应用CRISPR-Cas9构建基因打靶小鼠研究免疫学问题的优势及局限性，希望能够为应用CRISPR-Cas9技术的科研人员提供一些指导。
