12月25日，Nature刊发了纽约大学研究者关于表观修饰如何影响自闭症疾病及大脑早期发育调控机制的最新研究成果。在这项研究中，研究者发现Auts2基因会通过募集不同因子，将一类基因表达抑制因子逆转为基因激活因子，从而影响一些大脑发育相关的关键基因表达。
多梳家族蛋白(Polycomb group proteins，PcG)是一类通过表观遗传调控控制基因表达的蛋白，通常情况下，PcG蛋白主要会形成两类多梳复合体，对染色体组蛋白进行修饰，抑制基因表达，其中，多梳抑制复合体1(Polycomb repressive complex 1，PRC1)催化组蛋白产生H2AK119ub1修饰，而多梳抑制复合体2(Polycomb repressive complex 2，PRC2)催化组蛋白产生H3K27me3修饰，这两种修饰都会抑制基因表达。PRC1至少有PRC1.1-1.6这六种不同类型，每种类型各包含一种多梳家族指环结构(Polycomb group RING fingers，PCGFs)和E3连接酶RING1A/B及其他组件。
之前的研究已发现，PCGF3和PCGF5分别会与AUTS2这个蛋白形成新的复合物，而AUST2常在自闭症等精神损伤疾病中出现缺陷，而且在最近的研究中还发现aust2这个基因具有调控神经发育的功能，这些进展促使研究者对PRC1-AUTS2的功能展开探索。
利用串联亲和纯化(tandem affinity
purification，TAP)及质谱分析，研究者确认AUTS2与PCGF5、RING1A/B、RYBP/YAF2及CK2互作，组成了
PRC1.5-AUTS2复合体，且免疫共沉淀(Immunoprecipitation，IP)实验表明AUTS2与CK2直接互作，而RING1B只
在PCGF5存在条件下才会与AUTS2互作，这些实验结果表明，RING1A/B通过PCGF与AUTS2互作，同时招募RYBP/YAF2和CK2，
形成一个完整的PRC1.5-AUTS2复合体。
IP实验鉴定PRC-AUTS2复合体互作类型
接下来，研究者通过构建5个荧光素酶报告载体来检测PRC1.5-AUTS2的转录调控功能。这个载体中，荧光素酶基因转录起始位点上游包含一个转录激 活因子GAL4结合位点和一个可被四环素诱导表达的待筛选基因(GAL4–AUTS2，GAL4–RING1B，GAL4–PCGF4，GAL4– PCGF5以及单独GAL4)。将这些载体导入293 T-REx细胞后发现，四环素处理会增加GAL4-PCGF5或GAL4-AUTS2细胞内荧光活性，ChIP-qPCR显示GAL4-AUTS2主要被 招募到了报告载体的启动子区域附近，同时也有RING1B、CK2B和Pol II被招募，同时，与基因激活有关的组蛋白H3K4me3修饰上升，而与基因抑制有关的H3K27me3修饰则相应下降，在GAL4-PCGF5细胞中也 表现出在报告载体启动子区域中RING1B、CK2B、Pol II和H4K16ac修饰的富集以及H3K27me3的下调，如果用siRNA沉默GAL4-AUTS2细胞中的RING1B或PCGF5，或在 GAL4-PCGF5细胞中敲除AUTS2，都会降低荧光活性。这些结果表明PRC1.5-AUTS2会为转录提供一个有利的环境，促进基因转录。通过免 疫组化实验可以确认，在小鼠胚胎脑中，AUTS2主要分布在中枢神经系统中，ChIP-Seq实验确认，P1小鼠大脑中，AUTS2、RING1B和 P300会富集到与基因表达、前脑及大脑异常相关通路中的重要基因转录起始位点上游，这些位点也同时有Pol II、H3K27ac及H3K4me3组蛋白修饰富集。这些体外实验结果表明，PRC-AUTS2复合体已经将PRC原有的基因抑制功能逆转成了促进转录 发生的复合体。
荧光素酶报告载体示意图及GAL4-AUTS2和GAL4-PCGF5两个载体的ChIP分析结果
ChIP-Seq结果
ChIP-Seq及RNA-Seq分析AUTS2和RING1B共同靶基因
完整复合体示意图
对于这个复合体是如何逆转功能，研究者认为可能与CK2这个酪蛋白激酶有关。PRC1可以通过其复合体中的RING1B使得H2AK119单泛 素化，产生H2AK119ub1修饰，而在加入CK2后，通过酶活测定、放射性示踪发现及质谱分析发现，CK2会将RING1B中Ser41和 Ser168两个位点磷酸化，从而抑制RING1B的单泛素化酶活性;另一方面，使用293T细胞进行共免疫沉淀及pull-down实验，发现 AUTS2会与共激活因子P300直接互作，P300所具有的乙酰转移酶活性也导致整个PRC-AUST2复合体功能被逆转，促进组蛋白产生有利于转录发 生的修饰。
最后，研究者也构建了一种敲除了aust2的小鼠，在体内验证AUTS2功能，结果表明，敲除了aust2后，小鼠体积出现 明显下降、发育迟缓，感觉、运动、认知和沟通能力都有明显下降，且这些小鼠脑部多个AUTS2和RING1B共同靶基因转录明显被下降，再次证实 AUTS2对于脑部发育具有非常重要的作用，auts2损伤会引起严重的发育缺陷。
本项研究，利用ChIP-Seq、免疫共沉淀等蛋白质-DNA互作实验技术，探索了PRC-AUTS2这个复合体的功能。研究结果表 明，AUTS2基因会通过富集多种具有不同组蛋白修饰活性的因子，与PRC1.5组成复合物，通过磷酸化作用，将一个转录抑制复合体逆转成为一个转录激活 复合体，对自闭症等疾病相关基因表达有重要调控作用，也为开发此类疾病新型疗法提供了新的依据。
相关文献：Gao Z, Lee P, Stafford J M, et al. An AUTS2-Polycomb complex activates gene expression in the CNS[J]. Nature, 2014, 516(7531): 349-354.
