一 细胞培养基础问答
1) 什么是无血清培养基？与普通培养基有什么区别？
答: 无血清培养基(serum free medium,SFM)是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。基本成分包括基础培养基及添加组分两大部分。添加组分可能包括纤连蛋白、层粘连蛋白等贴壁因子、胰岛素、转铁蛋白、硒等。
2) 什么是化学成分明确的无血清培养基？
答：化学成分明确的培养基只含有分子量和浓度已知的组分。
3) 使用无血清培养基或组分有什么优点？
答：批间一致；化学成分明确；与含血清培养基相比，蛋白产量高、细胞死亡率低、细胞活性高；培养基性能稳定，后续分离纯化容易，因此无需预先筛选血清批次，简化了生产规程。
4) 什么是干细胞？它与其它细胞的区别在于什么方面？
答：干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，例如血细胞、神经元细胞、心肌细胞、皮肤细胞等。它与其它细胞的区别在于：自我更新和多潜能性。
5) 不同来源的干细胞，其分化效率是否差异很大？
答：干细胞的多能性是跟其来源和制备等密切相关的。通过不同的重编程方法得到的不同iPS细胞也会有不同的分化效率。
6) 用不同培养基培养细胞，观察到的细胞形态会否是其多能性的外在表现？
答：StemRD合作者System Biosciences做过marker的检测(P28)，结果在PSGro宣传页上，网站上也放了。多胚层分化也做过。另外，我们自己做过多次心肌和褐色脂肪分化。除了这些结果，可以试着向顾客解释，不同培养基对细胞形态多少会有些影响。mTeSR1中含大量（1%）的BSA，BSA对细胞形态有影响，而PSGro不含BSA，只有少量HSA，形态更象E8培养的细胞。而在feeder和KSR上养的细胞更分明。细胞形态跟干性没直接关系。我们的marker和分化结果证明这点。
二 培养基生产和使用常见问题
1) 我能用DMEM替代DMEM/F12么？
答：DMEM/F12培养基是DMEM培养基和F12培养基的1:1混合物，因此DMEM/F12的营养好于DMEM。
2) 为什么有的培养基是红色，有的是无色的？什么培养基中可以省去加酚红？
答：酚红在培养基中用作pH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。酚红本身对生物制品质量并不会产生影响，可以通过纯化技术去除，但酚红在无血清培养基可能带来胞内钠/钾失衡，影响细胞生长。但在有血清培养中，这种作用能被血清中和或减轻。 酚红并不是培养基中必需的一种成分，很多国外的疫苗或抗体生产企业在生产过程中都使用无酚红培养基。
3) 放置在冰箱中的培养基颜色会发生变化，为什么？
答：培养基保存于4℃冰箱中，培养基内CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中酸碱指示剂（通常为phenol red）的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱后再用于细胞培养将造成细胞生长停滞或死亡。培养基偏碱时，可以通入无菌过滤的CO2，以调整pH值。
4) 无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗？
答：当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。因为血清中的蛋白会结合和灭活一些抗生素。而在无血清培养条件下，抗生素不被灭活。
5) 细胞培养基里添加抗生素是不是必须的？
答：抗生素的作用主要是防止细胞培养液中添加成分或者细胞培养操作过程中带来的外界污染，加入抗生素可以有效降低细胞污染的几率，但视培养条件和培养环境的差异而定，抗生素也不是必须添加的。
6) 细胞培养基偶然被冻，可否继续使用？
答：如果细胞培养基偶然被冻，您应该自然溶解培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。
7) 如何提高有血清培养的细胞向无血清培养条件转化的成活率？
答：一般而言，将细胞从血清培养条件过渡到无血清培养需要一个过渡，可以先尝试梯度减少原培养基，加入无血清培养基，直到最后完全替换为无血清培养基即可。最好不要突然全部换掉原培养基，细胞可能会由于环境的突然改变不适应而减缓增殖或出现大量分化。
三 细胞培养常用试剂使用问答
1) 培养细胞生长减慢的原因有哪些？其解决办法有哪些？
答：可能得原因有：更换了不同的培养液或血清；培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子等耗尽或缺乏或已被破坏；培养物中有少量细菌或真菌污染；试剂保存不当；比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验找出可能的原因。解决办法：增加起始培养细胞浓度；让细胞逐渐适应新培养液；换入新鲜配制培养液；补加谷氨酰胺或生长因子等；用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物，或用抗生素除菌；血清需保存在-5℃到-20℃；培养液需在2－8℃避光保存；含血清完全培养液在2-8℃保存，并在2周内用完；分离培养物，检测支原体。
2) 培养基中丙酮酸钠的作用是什么？
答：丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。
3) 用EDTA/胰酶消化MSCs好么？
答：EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。
4) 如何判断培养的细胞是否污染？
答：细胞污染的话，从表象来看，培养基会发黄浑浊，如果还可以用肉眼看到一层细沙状的污染物沉积在培养液底部，则是典型的细菌污染，在电镜下还可以看到黑点状的细菌在不断晃动；如果肉眼看见的是白色的丝状或者类似絮状的物质，在电镜下也可观察到类似现象，则可判定为真菌污染。但具体是哪一类的细菌或者真菌污染，还需要更进一步的分析研究。
5) 细胞倍增数（PD）和“传代”之间的区别是什么？
答：细胞倍增数（PD）是在体外培养过程中细胞总数的2倍增加。在某个特定的时间点进行细胞倍增数的计算能够给出一个准确的细胞年龄。相比之下，传代仅仅是指子代培养过程，即从培养容器分离细胞（使用胰蛋白酶/EDTA或accutase），然后以较低的密度接种，以便作进一步的细胞生长。传代通常不考虑可应用的不同的分裂比率。不同的分裂比率产生一个独特的传代数量，但细胞倍增数是变化的。因此，传代只是对实际培养年龄的一个粗略估计。
6) 培养正常人体细胞可以添加抗生素么？
答：为了使细胞实现最佳的生长，我们建议不要使用抗生素。在添加抗生素的情况下，大多数原代的或者正常的人体细胞的生长活性都会降低。在某些情况下，当不能保证100%的无菌环境时，为了防止潜在的微生物感染，建议在培养基中添加抗生素。
7) 冻存的细胞和增殖中的细胞之间的区别是什么？
答：一般运送细胞需要用干冰进行保存，运输抵达后，必须转移到液氮中保存，或者解冻后直接接种到合适的培养基中，并使用合适的组织培养瓶培养。
8) 如何提高复苏细胞的成活率？
答：要想提高细胞复苏的成活率，一方面要注意在操作时候轻吹轻刮细胞，另一方面可以在复苏细胞的培养基中添加适量的细胞活化生长因子，例如2.5uM的Thiazovivin等，不仅可以减缓冻存液中DMSO对细胞自身的伤害，还可以促进复苏细胞的贴壁生长。
9) 细胞复苏的原则是什么？
答：快速融化。必须将冻存在-80°C液氮中的细胞快速融化至37°C，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
四 细胞培养过程常见问题
1) 为什么培养的细胞要及时传代？
答：体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长，及时传代后，细胞的生长得以继续。<, /SPAN>
2) 培养液pH对细胞生长的影响？
答：由于大多数细胞适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围可能对细胞生长将产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受力强。但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些。在配制培养用液时，需要注意一点：新配制的培养基在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。
3) 复苏购买的细胞冷冻管经解冻后，为什么有时会发生细胞数目太少？
答：研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。但对于DMSO敏感的细胞，还是复苏细胞时，用离心去除DMSO比较好。
4) 复苏购买的细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？
答：研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，原因比较复杂，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；解冻过程错误；冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心；悬浮细胞误认为死细胞；培养温度使用错误；细胞置于–80℃太久等。建议严格参照ATCC或ECACC的标准操作规程进行细胞复苏、冻存等工作。
5) 支原体污染会对细胞培养有何影响？
答：支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数、代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
6) 培养细胞出现死亡其可能的原因有什么？解决办法有哪些？
答：可能的原因有培养箱内无CO2；培养箱内温度波动太大；细胞冻存或复苏过程中损伤；培养液渗透压不正确；培养液中有毒代谢产物堆积等。解决办法可以检测培养箱内CO2浓度，检查培养箱内温度；取新的保存细胞种；检测培养液渗透压等；换入新鲜培养液等。
7) 为什么MSCs被培养到P8之后就减缓增殖了呢？
答：首先这个问题得看培养的细胞是什么细胞。一般来说，骨髓来源的MSC细胞其活力本身就不如脐血或者脐带来源的MSC，因此有文章指出P9及其以后的骨髓MSC不应该用来做科学研究并不应作为收录文章时考量的真实数据标准。因此，不论是使用何种培养基产品，都应该找到适合所培养的细胞的培养基，才是正确的选择。
8) 如何判断细胞合适的传代时间？
答：一般来说，在电镜下观察细胞长满孔板（或者培养板/瓶）的85-90%为最佳传代时间点。但具体的传代时间也因具体实验的要求、所需细胞的数量而有所调整。但如果细胞长不满50%就传代的话，也会影响细胞自身的增殖和生长。
9) 细胞传代的比率和密度如何确定？
答：细胞传代的比率和密度要视具体情况而定，最基本的就是要观察细胞形态、数量、实时密度等，还有距离上次消化后，细胞长好的完整度时间。最好在其培养过程中，尽可能地去观察其形态，数量增长状况，及其液体的颜色变化（颜色的变化最直接的体现就是pH的变化）。如果在显微镜下观察细胞形态好、数量多、密度大，判断细胞处于对数生长期，此时传代比例可以稍大于平常。例如MSC细胞，通常判定传代后的新一代细胞大概需要3-4d长满孔板为宜。
10) 培养MSCs是否需要提前铺板？
答：针对不同的培养基要求不同，有一些培养板需要提前铺板包被才可以使用，但MesenGro并不需要再对使用的培养板进行铺板包被处理，配合Corning的CELLBIND系列培养瓶，MSCs可以直接进行培养或传代等，大大节省了铺板胶的成本和人力成本。
11) 日常培养MSCs的过程中，是否需要每天换液？
答：细胞培养换液时间应该根据细胞生长的状态和实验要求一同确定。一般2-3d应该换一次生长液。传代操作的第二天最好换液，及时给新传代的细胞补充营养成分，更有利于细胞的生长。
12) 挑取iPS/ES克隆团主要方法？
答：常规操作是在电镜下，用高温下拉成毛细管的玻璃吸管挂掉已经分化的区域，但这种方法耗时很长，需要特别耐心仔细；另一种比较简便的方法就是用马克笔在电镜下观察的已经分化的细胞克隆团处做上记号，再用移液枪吸走做了记号地方的细胞即可，但这种方法损失的细胞较多。
13) 一套无血清培养基，向基础培养基中添加补充剂之后培养基可以使用多久？
答：一旦已经向基础培养基中加入补充剂，则在4°C的保质期为6-8周。尽量避免将培养基重复加热至37°C，这将降低生长因子的活性和L-谷氨酰胺的浓度。
14) 做EB的分化，有哪些marker可以用于鉴定EB向三胚层的分化？
答：以下仅供参考：
ectoderm: otx2, N-200, GFAP, AchE, TH, MBP, Nestin, PAX6, KER， NEUROD1
Mesoderm: Brachyury, ANF, cTnT, CMP,
endoderm: AFP, Foxa2, Foxa3, GATA4, GATA5,
Amnionless, Glucagon, AMγ
