自RNAi技术诞生以来，科学家们便一直希望将其应用于疾病治疗中。自然的RNAi过程中，内生的双链RNA（double-strands RNA）会被Dicer和RNase III切割成为21nt长度的siRNA，siRNA中与靶点序列互补的guide strand再同Ago2这种RNA内切酶包装成为siRISC复合体，结合到靶基因上，产生RNAi效应，而siRNA中的另一条链passager strand会被消化掉。科学家们一直希望通过体外直接合成siRNA，沉默某些疾病的特异性靶点，达到治疗效果。
本项研究中，研究者没有采用传统的修饰方法，他们将一个靶向SIRT1基因的siRNA的两条链分别同一段19nt长的DNA单链连接起来，构建了四种siRNA-DNA复合体（guide-3'-DNA/ds siRNA、passenger-3'-DNA/ds siRNA、guide-3'-DNA/sssiRNA、passenger-3'-DNA/ss siRNA），这段DNA单链末端携带有一个微型的发夹状结构。
几种siRNA-DNA设计图
由于沉默SIRT1会引起细胞凋亡程序启动，研究者首先使用流式细胞术及相差显微镜检测了转染四种复合体的结肠癌细胞HCT116的凋亡效果。结果发现，转染了guide-3’-DNA/dsRNA、passenger-3'-DNA/ds siRNA和guide-3'-DNA/ss siRNA三种复合体的细胞中，SIRT1 mRNA及蛋白均出现了明显下调，细胞也出现明显凋亡现象，但passenger-3'-DNA/ss siRNA则基本没有效果。对于细胞凋亡的原因，研究者通过Western blot确认是SIRT1的沉默导致其所调控的p53蛋白被激活，从而激活了细胞凋亡程序。之后借助RNA pull down及qPCR实验，研究者也确认，这三个含有guide RNA的复合体会同SIRT1 mRNA、Ago2、eIF6和C3PO蛋白组成一个siRISC，沉默SIRT1基因。
几种复合体对SIRT1 mRNA沉默效果对比
几种复合体对p53蛋白的影响
几种复合体的细胞凋亡效果
RNA pull down实验结果
几种siRNA抗血清RNase效果
虽然这三个复合物的沉默效果不错，但研究者也承认它们并没有表现出比未修饰的SIRT1 siRNA明显更强的沉默效率，通过实验，他们证实此修饰最大的作用是阻止siRNA被血清中的RNase消化掉，从而保证siRNA最大程度发挥作用。在使用血清孵育HCT116细胞后， 三种复合体中，guide-3'-DNA/ds siRNA、passenger-3'-DNA/ds siRNA仍然能够产生明显的沉默效果，引起细胞凋亡反应，而guide-3’-DNA/ss siRNA虽未能达到前两种复合物的抗RNase效果，但也与未修饰的siRNA效果相当。
这个具有抗RNase效果的siRNA修饰是本项研究的最大亮点，它也为日后设计治疗用siRNA提供了更多指导，利用此类修饰，研究者可以开 发出血清中更稳定、沉默效率更高、持续时间更久、特异性更强的siRNA类药物，为包括癌症等传统药物无能为力的疾病提供更多治疗手段。
相关论文：Allison S J, Milner J. RNA Interference by Single-and Double-stranded siRNA With a DNA Extension Containing a 3′ Nuclease-resistant Mini-hairpin Structure[J]. Molecular Therapy—Nucleic Acids, 2014, 3(1): e141.
