美国杜克大学研究者在其最新研究工作中发现，miR-33a同恶性胶质瘤的发生有密切联系。这项重要发现已于9月14日发布于JCI。
恶性胶质瘤(Glioblastoma，GBM)是最常见、最致命的一类脑肿瘤。它的发生多与胶质瘤起始细胞(Glioma-initiating cells，GICs)有关，GICs是一类具有干细胞特性的细胞，分化程度低、具有多向分化潜能、自我更新能力强。虽然这类细胞在肿瘤组织中数目很少，但却对肿瘤的发生、发展及转移起到了至关重要的作用，彻底消灭干细胞是治疗肿瘤的一个关键因素。
本文中，研究者希望了解与GICs有关的miRNA表达变化。他们选择新鲜的病人样本， 使用两种不同方法富集出了两种GICs(CD133+和CD133-)，使用芯片检测了GICs中80个miRNA表达变化，发现有6个miRNA出现表 达上调，但只有miR-33a在后续实验中会促进神经球的产生，再结合更多临床样本验证，最终确认miR-33a是GICs发生相关miRNA。
不同GICs中miR-33a表达量对比
miR-33a过表达的GICs呈现出胶质瘤状
miR-33a“海绵”对miR-33a的沉默效果
Ago2 RNA pull down实验示意图
miRNA ISH实验效果图
为了进一步了解miR-33a在GICs中的具体功能，研究者选择了两种手段来降低GICs中的miR-33a表达量。一种是以慢病毒为基础构建的 miR-33a“海绵”;另一种则是通过miRZIP方法表达反义RNA来抑制miR-33a功能。结果发现，两种方法都可以在GICs中有效抑制 miR-33a表达，并能明显降低GICs形成神经球的能力，削弱其干细胞特性，阻止其自我更新，同时在小鼠体内明显减缓肿瘤生长速度。接下来，研究者又 在非GICs神经胶质瘤细胞中转入慢病毒上调其中miR-33a表达量，利用流式细胞仪检测发现这些细胞出现了明显的干细胞特性，成神经球能力大幅提升， 细胞转入体内后成瘤能力与速度也显著上升。
以上结果已基本可以确认miR-33a在GICs中的作用。接下来研究者希望找到miR-33a在GICs中的作用通路。他们首先对过表达miR-33a的神经胶质瘤细胞进行了芯片和qPCR检测，再结合进一步的AGO-2抗体 RNA pull down实验、Western blot实验和荧光素酶报告基因检测，最终确认PDE8A基因和UVRAG基因是miR-33a的直接靶点。
这两个基因从来没有被报道过与GBM产生有关，但是研究者在非GICs神经胶质瘤细胞中同时敲除这两个基因后，也会促进细胞干细胞化，其生长速 度与成神经球速度明显加快，这些结果页与miR-33a过表达一致。这也进一步证实PDE8A基因和UVRAG基因是miR-33a的直接靶点。
PDE8A基因属于磷酸酶家族，会选择性水解cAMP。由于胞内蛋白激酶A通路(protein kinase A, PKA)的激活依赖于cAMP，且抑制该通路会明显减少GIC形成神经球速度，研究者假设miR-33a会通过调节PDE8A基因最终促进PKA激活，加 速GIC形成神经球。过表达和沉默实验结果表明，PDE8A基因对PKA标志物p-CREB呈负相关调控关系，且沉默PED8A基因也会促进其他PKA通 路相关基因表达;而miR-33a另一个靶点UVRAG基因已被报道同细胞自噬和染色体稳定性有关，是一个肿瘤抑制物，也有研究表明UVRAG基因可以调 控NOTCH内吞，而NOTCH对于GICs的自我更新及抗药性也非常重要，研究者假设miR-33a是通过UVRAG对NOTCH进行调控。实验证 明，UVRAG会通过影响NOTCH的胞内结构域对NOTCH起到拮抗作用，当GICs中miR-33a过表达时，UVRAG受到抑制，NOTCH则被激 活，促进GICs自我更新。
在本项研究中，研究者确认了与GICs自我更新相关的miRNA：miR-33a，并详细阐述了这个miRNA在GICs中的作用机制。对于 miR-33a过表达的原因，研究者认为是其宿主基因的启动子中CpG岛脱甲基化所造成。本项研究所确认的miR-33a/PDE8A/PKA和miR- 33a/UVRAG/NOTCH作用通路，对于日后进一步研究神经胶质瘤的发生、开发新型抗肿瘤药物及提高预后结果具有非常重要的意义。
相关文献：miR-33a promotes glioma-initiating cell self-renewal via PKA and NOTCH pathways
