在医学及生物学的重大发现背后，DNA测序是一个重要的驱动力量。例如，对个人全基因组的完整测序可以为医疗诊断和治疗提供重要的生物标记和指导。到目前为止，获得高准确度的DNA测序结果的障碍是测序成本与速度。
在过去十多年， DNA测序技术已经获得了许多的进展，当前大多数的高通量测序仪是基于光学技术，对构成DNA链的四个碱基A、T、C、G进行检测。而根据新的研究成果，纳米孔测序技术成为测序技术发展的一个新兴方向。
纳米孔测序的理念基于这样一个现象：当一个纳米孔沉浸在一种可导电流体中，并被施加电压时，贯穿纳米孔之中可产生一股电流。当一个分子，比如一个核苷酸分子穿过这个纳米孔时，纳米孔之中的电流则会发生暂时的特定变化，这种电流上的干扰是可检测的。不过问题是，由于四种碱基在化学结构上的相似性，使得它们穿过纳米孔时导致的电流变化也很相似。目前已有的纳米孔测序方法并不能100%地准确分辨四种碱基，从而导致测序结果可能不准确。
为了解决现有纳米孔测序技术存在的这个问题，哥伦比亚大学基因组技术与生物分子工程中心主任车靖岳(Jingyue Ju)领导的一个研究小组开发了一种新型纳米孔测序技术。2005年，车靖岳曾发明了对DNA四种碱基进行染色的方法，从而开发出更为经济和便捷的DNA测序技术，并与同伴Steven Gordon成立了新一代测序公司Intelligent Bio-Systems(IBS)。2011年，IBS推出了它的第一台测序仪Max-Seq。2012年，IBS研发了更小型的台式测序仪(Mini-Seq)，直接瞄准临床市场。这种小型台式测序仪可一次性独立处理20个样品并进行高效测序。今年6月，IBS接受了凯杰公司(Qiagen)的收购。
由车靖岳领导开发的新的纳米孔测序方法利用了体积较大、更易于识别的PEG分子来替代四种不同的碱基。在DNA链的5′末端，其磷酸基是可以被PEG之类的标签物修饰，且不会影响DNA聚合酶对被修饰碱基的识别，这是这种新方法奏效的根本原因。
研究人员因此对四种碱基进行修饰，每种碱基连接有一个特定的PEG标签。这种修饰过的碱基然后被用于DNA链的延伸。当每一个碱基在聚合酶的作用下连接到一条正在延伸的链时，其PEG标签会被释放出来并通过纳米孔。由于PEG相比碱基来说其体积要大的多，且每种碱基上连接的PEG并不一样，因此相比不同碱基通过纳米孔时产生的电信号差异，不同PEG所引起的信号差异要明显的多。只要对PEG进行分辨即达到了分辨碱基的目的，大大提高了碱基阅读的准确性与效率。
四种碱基携带不同PEG标签，在DNA链延伸过程中PEG被释放导致纳米孔中电流发生不同变化
由于PEG标签体积大，扩散速度低，因此极大地提高了它们通过纳米孔并产生电流阻断信号的几率。同时，由于聚合酶延伸速度与标签释放速度非常低，因此也没有必要设法降低标签通过孔隙的速率，从而有效避免了目前已有的纳米孔测序技术面临的问题：如何降低DNA链通过纳米孔的速率。
研究者利用携带不同长度PEG-香豆素标签的核苷酸对这种技术进行了验证。结果表明，在DNA聚合酶反应过程中，修饰过的碱基能够有效连接至DNA链，且不同标签经过纳米孔时能够被准确识别。在验证研究中，研究者利用的是α-溶血素的蛋白质纳米孔。他们声称，这种方法也可以采用其他的蛋白质或者固态纳米孔。并且，他们的验证试验中所使用的香豆素标签也可以被其他更大或不同电荷的标签所取代，以增强纳米孔的识别效果。
研究者们表示，构建一个大型的纳米孔阵列将使得这种技术可用于高通量DNA测序。
PEG-Labeled Nucleotides and Nanopore Detection for Single Molecule DNA Sequencing by Synthesis
Shiv Kumar, Chuanjuan Tao, Minchen Chien, Brittney Hellner, Arvind Balijepalli, Joseph W. F. Robertson, Zengmin Li, James J. Russo, Joseph E. Reiner, John J. Kasianowicz & Jingyue Ju
We describe a novel single molecule nanopore-based sequencing by synthesis (Nano-SBS) strategy that can accurately distinguish four bases by detecting 4 different sized tags released from 5′-phosphate-modified nucleotides. The basic principle is as follows. As each nucleotide is incorporated into the growing DNA strand during the polymerase reaction, its tag is released and enters a nanopore in release order. This produces a unique ionic current blockade signature due to the tag's distinct chemical structure, thereby determining DNA sequence electronically at single molecule level with single base resolution. As proof of principle, we attached four different length PEG-coumarin tags to the terminal phosphate of 2′-deoxyguanosine-5′-tetraphosphate. We demonstrate efficient, accurate incorporation of the nucleotide analogs during the polymerase reaction, and excellent discrimination among the four tags based on nanopore ionic currents. This approach coupled with polymerase attached to the nanopores in an array format should yield a single-molecule electronic Nano-SBS platform.
文献链接：PEG-Labeled Nucleotides and Nanopore Detection for Single Molecule DNA Sequencing by Synthesis
