锌指核酸酶或可修改疟原虫基因
近期的《自然—方法学》报道了如何利用特定核酸酶对导致疟疾发病的恶性疟原虫的基因组进行修改。这项发现将有助于从遗传层面包括抗药性机制上更深入地研究这种重要的人体寄生虫。
全球有数以百万计的人饱受疟疾侵害，而抗药性是疟疾治疗过程中普遍存在的问题。针对引发疟疾的原生动物寄生虫的研究受到阻碍，原因在于缺乏耐用的研究工具，特别是那些能操控这些寄生虫基因组的工具。
锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)，又名锌指蛋白核酸酶，不是自然存在的，而是一种人工改造的核酸内切酶，由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成，其中DNA识别域赋予特异性，在DNA特定位点结合，而非特异性核酸内切酶赋剪切功能，两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂。
David Fidock等人在文章中报告了如何利用这类工具修改恶性疟原虫这种最致命疟疾寄生虫的基因组。该寄生虫基因组中核苷酸的平衡量及其内生DNA修复的机械性因素中的某些方面与其他有机体有所差别，其中，DNA修复的机械性因素本可能削弱ZFN的作用效果。但研究人员展示了他们利用该工具对恶性疟原虫基因组有效的操控，他们使用ZFN删除一些基因、替换掉一个基因，以快速而有效的方式改变了其基因序列。
>> 锌指核酸酶技术在基因重组中的应用
在植物上，Lioyd 等(2005)在拟南芥中用ZFN诱导了染色体基因的定点突变，后代的突变率高达 20%。Voytas的研究小组证明ZFNs可以提高植物基因定点整合和置换频率，他们在实验中设计了一个缺失了600bp的靶基因GUS:NPTII,将含有该600 bp的同源DNA片段和ZFNs瞬时表达载体共同转化烟草原生质体，转化细胞的10%获得基因定点置换，比不用ZFNs时效率提高了104~105倍。分子检测表明20%的重组事件是精确的，没有伴随碱基的缺失或插入(Wright et al.,2005)。这一结果表明利用ZFNs定点切割染色体DNA，可以显著提高同源重组介导的基因定点整合效率，这为基因定点整合和置换提供了一个非常有潜力的工具。而2009年Meng等和Townsend等分别利用ZFN在玉米和烟草开展研究并且在《Nature》杂志上发表研究成果，其中陶氏益农与Sangamo公司的科学家利用ZFN将一种杂草耐性基因导入玉米基因组的预设位点，破坏玉米中的ZmIPK1，永久性地与杂草耐性基因相连，将两个需要的性状堆叠在一起，抑制肌醇六磷酸的合成，抗除剂基因通过正常繁殖遗传到下一代，获得了抗除草剂和减少肌醇六磷酸水平的双重好处；而明尼苏达大学和麻省总医院基因组工程研究中心的研究人员利用ZFN改变烟草植物细胞单个基因的序列，获得了抗除草剂特性的烟草。
在哺乳动物上，2009年Geurts等报道了利用ZFN技术获得的基因敲除大鼠，这是该技术首次成功地在哺乳动物胚胎中进行基因操作，研究人员设计了三种ZFN，分别以外源基因GFP、内源基因IgM和Rab38为靶点，将编码ZFN的DNA或mRNA通过原核注射或胞浆内注射的方法导入大鼠胚胎中，从而获得了敲除特定基因的转基因大鼠，而且这一基因操作的结果可稳定遗传。2010年Mashimo等将编码特定ZFN的mRNA原核注射至大鼠受精卵中，敲除了IL-2受体γ链基因，从而获得了X连锁重症联合免疫缺陷（X-SCID）大鼠，为评估药物治疗和基因治疗的效果提供了新的动物模型。ZFN技术在其他哺乳动物身上也得到了成功应用 2010年Carbery等采用ZFN技术成功地敲除了小鼠的Mdr1a、Jag1、Notch3三个基因。2011年Whyte等利用ZFN技术在带有增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因的转基因猪的成纤维细胞中敲除eGFP基因，得到了不能发出荧光的后代，成功建立了大动物基因敲除模型。
ZNF技术亦具有潜在的临床应用前景。传统的基因治疗的方式主要有两种，一种是利用病毒携带完整的基因序列送入人体内或者是注入一小段正确的DNA序列来修正错误或者使错误的基因不表现，然而到目前为止，事实上科学家都无法确认这些方法在实际应用上是有效率及安全的。而藉由同源互换的原理使得细胞自行修正错误的DNA序列是发展基因治疗上最基本的原则。这一过程通过两个独立的步骤完成：首先在DNA中引入一个双链断裂，启动细胞自身的修复系统；之后“同源重组”参考引入的相似序列作为模板修复这段基因，从而实现指定部位的碱基替换。
2005年Urnov等针对一个IL2R基因上的突变而引起X-SCID来设计了四个锌指结构域串联的ZFN。SCID会使T细胞失去对抗外界入侵及感染的能力，而科学家们结合注入正确的DNA片段及ZFN的方式在培养皿中处理这些SCID的T细胞。利用该系统介导了人类细胞IL2R酌的高效修复。在无选择压力下修复效率达15%~18%，而实际在体内，修正后的细胞比原来的突变细胞具有选择优势，故这样的修复效率已足够用于基因治疗。
2008年Perez等使用锌指蛋白技术为载体携带特异的酶阻断T细胞中的CCR5基因的表达可促进T细胞清除HIV病毒，研究结果表明，改造的T细胞可有效抵抗HIV。在此几年前Sangamo生物技术公司就开始设计用于与CCR5基因结合并阻断CCR5活性的酶，阻断CCR5活性可激活T细胞抵抗HIV的能力。通常HIV病毒紧紧吸附在CCR5表达的蛋白上，并感染T细胞，我们知道在自然条件下CCR5基因突变的人对HIV具有天然的抵抗力。Sangamo公司开始与位于宾夕法尼亚州费城的Abramson Family 癌症研究所Carl June带领的实验室开展合作，设计各种应用酶，从中筛选最适合用于阻断CCR5基因的酶。他们发现最佳的酶可阻断人类T细胞中40-60%的CCR5基因的表达活性。
2011年6月Li等通过使用ZFN替换体内的一种功能异常基因hF9，研究人员成功地使患有人血液疾病乙型血友病(hemophilia B)的小鼠恢复了差不多正常的血液凝结功能。这种成就代表着科学家们第一次已经能够利用ZFN进行的“基因组编辑(genome editing)”来永久地校正活的动物体内的细胞DNA，也为这种技术可能有朝一日用来治疗很多人类疾病提供希望。与称自己为“锌指公司”的里奇曼生物技术公司合作，Li等构建了患有人类遗传缺陷导致的乙型血友病的小鼠---这种疾病是一种遗传性出血性疾病，特征在于极其低水平((比正常水平的1%还要少)的凝血因子IX，而这种蛋白是凝血必不可少的。研究人员随后设计了一种ZFN来切割功能失常的hF9基因的前端，利用一种病毒载体携带这种酶到小鼠的制造凝血因子IX的肝脏中。他们将这种ZFN跟一种不同的载体携带的正常基因密码的模板一起注射进两天大的小鼠的腹部。当小鼠为9周大时，研究小组开始在治疗过的一组小鼠和对照组小鼠血浆中测试人凝血因子IX，结果治疗过的小鼠中凝血因子水平与正常水平的6-7%一样高---足够高使得它们的血液在近乎正常的时间内凝结。
2011年7月Frank Soldner等第一次在人类干细胞中修饰了单个引起疾病的突变，同时也不用改变干细胞基因组的任何其他部分。来自怀特海德生物医学研究所(Whitehead Institute for Biomedical Research)Rudolph Jaenisch实验室的科学家们利用锌指核酸酶在诱导性多功能干细胞α-突触核蛋白(alpha-synuclein)基因---已知该基因在帕金森疾病(Parkinson's disease, PD)上发挥作用---小心谨慎地插入或移除单个碱基对。该方法具有对病人起源的人iPSCs(huamn iPSCs, hiPSCs)中引起疾病的点突变进行基因校正的强大能力，代表着基础生物医学研究的巨大进步和基于人iPSCs的细胞替代治疗方面的一次飞跃。
2011年8月Hoeher等已成功地证明基于ZFN的基因治疗技术可以让导致皮肤起疱的缺陷性蛋白失活。研究人员利用ZFN在体外成功地关闭人皮肤干细胞中导致皮肤起疱疾病的致病基因，为了更好地证明这种方法可行性，研究人员利用基因工程手段改造皮肤干细胞，使之携带绿色荧光蛋白基因，然后用同样的特异性ZFN进行处理，结果在每五个处理的细胞当中成功地关闭了其中一个细胞产生的绿色荧光，而且即便在用高剂量ZFN处理后，皮肤干细胞仍保持着它们再生皮肤的全部潜力。这就为利用ZFN开展基因治疗提供希望。
2011年10月Sangamo生物技术公司在Nature杂志上发表一项临床前研究论文证实可以利用ZFNs来进行高度特异性和功能性地校正从病人皮肤细胞获得的iPSCs中α1-抗胰蛋白酶(Alpha 1-Antitrypsin, A1AT)的基因缺陷。研究人员首先使用ZFNs在正确的地方将该基因的基因组剪断，并用 piggyBac转座子的将正确版本的基因插入其中，再将该转座子序列从细胞中剔除，并将人体诱导多能干细胞能转化为肝脏细胞，而在修正位点没有出现任何DNA被破坏的痕迹。随后，科学家们通过在试管和老鼠实验中观察正常α1-抗胰蛋白酶蛋白的活动，证明这种经过修正的基因在他们制造出的肝脏细胞中非常活跃。重要的是，对ZFN校正的iPSCs细胞系进行全编码序列分析表明ZFN活性带来的唯一修饰就是对存在缺陷的A1AT基因的修复，从而证明利用ZFNs技术可以实现非凡的特异性，同时还表明基于ZFN的基因组编辑技术的精准性和广泛适用性使得该技术可以用来治疗单基因疾病。
