上周在美国冷泉港(Cold Spring Harbor)参加了单细胞分析会议(single cell analysis)， 这是一个非常令人激动的前沿学术会议，深深的体会到了单细胞基因组学的时代已经来临。
Cold Spring Harbor的会议是公认的高水准的会议，它有几个特点：首先，所做的报告都是最新的研究，组织方特别强调，希望介绍尚未发表的研究进展。我们知道，当一篇文章发表出来了的时候，这个研究一般在一年之前就已经基本结束了。鼓励把正在进行中的项目拿出来讲，保证的这个会议的前沿性。现场的报告都有清晰的录像，考虑到许多的talk是未发表的工作，这些录像只有参会者才有权利看到。其次，会议有大量的讨论时间。包括两次茶歇，wine and cheese party, banquet,还有晚上一直开放的酒吧。给了与会者许多非正式交流的机会。第三，收费贵，参加的基本都是PI，受邀或者从提交的abstract挑选出的speaker都是这个领域里做的最好的人，我自己能被选中做presentation，感到非常有幸。
单细胞测序最早的文献，据我所知应该是Harvard的George Church在6年前Nature Biotechnology上发表的。由于当时测序的价格昂贵，并没有立刻开始广泛应用。随着二代测序的普及，单个基因组测序价格降到5000美元，单细胞测序迎来了迅猛发展的时刻。2012年，单细胞测序研究所发表的文献包括，华大基因两篇Cell文章上介绍的对上百个肿瘤单细胞基因组测序的分析， 斯坦福大学Stephen Quake在Cell上发表的对单个精子的测序， 哈佛的Sunny Xie实验室发表的两篇Science上的文章介绍一个新的单细胞测序技术， 还有Cold Spring Harbor的Jim Hicks在Nature上发表的对乳腺癌的单细胞CNV研究等。从文章的档次上可以看出，单细胞基因组学的势头相当强劲。
单细胞测序技术最常用的方法是MDA方法，这种方法的优点是对基因组的覆盖率高，缺点是扩增不均匀，比较适用于做SNP和mutation相关的研究。我实验室用这个方法做的单细胞的覆盖率在1X的深度下就达到了30%。 有意思的是这次会议中，有一半的talk是关于微流控技术的。原因是，微流控平台是公认的可以降低单细胞测序的噪声，使得基因组扩展更加均匀。同时微流控平台也适合于分离单细胞。最近Fluidigm出了一个C1的单细胞扩增仪器，现场几乎所有做单细胞的实验室都表示出了购买的兴趣，足见微流控技术的吸引力。单细胞测序最容易出现的问题是污染，一般建议是在专门的独立的超净间里进行，并且此超净间不应该做任何非单细胞的实验。
目前单细胞研究的主要应用领域包括肿瘤，循环肿瘤细胞，干细胞等。但有意思的是，现场的好几个报告都不约而同的做了同样东西，看来大家的想法都非常相近。看了本篇博文的博友如果有兴趣做单细胞基因组研究，请慎重，很有可能你的想法别人已经做到9成，接近发表了，我非常欢迎感兴趣的人和我讨论或者合作。
作者介绍：
贺建奎，南方科技大学的副教授，研究领域：遗传学与生物信息学中的基因组学。
>>延伸阅读单细胞基因组测序技术流程
单细胞基因组技术是06年之后开始火起来的，已经应用到各个领域，植物细胞、微生物和动物细胞尤其是人体细胞。做这个东西有三个难点：第一，是单细胞的获取；第二，单细胞基因组的多重扩增；第三，就是高通量测序以及组装。
第一，单细胞的分拣
1. 梯度稀释：类似于微生物的纯培养手段，既繁琐也容易污染。
2.显微操控：在显微镜小用类似于注射器的装置分离单细胞，可操作性不好；
3. 流式细胞分拣：流式细胞分拣可以分离大量的同类型的细胞，也是在MDA技术出现之前最普遍使用的方法，现在也有很多实验室再使用。缺点仍然是对实验室净化要求极高，而且并不能实现完全意义上的单细胞测序。
4. 微流控芯片：就是博主所提到的最火的，这个技术的优点在于细胞分拣和单细胞的多重扩增可以在一张芯片上完成，而且依据芯片的设计，可以同时做多个细胞的扩增，就是传说中的芯片实验室（Lab on a Chip），扩增完成之后，收集扩增产物，检测扩增产物的扩增质量就可以做相应的测序准备了，剩下测序和组装的跟宏基因组测序类似。
第二，单细胞基因组的多重扩增
目前单细胞基因组测序的关键点在于足够的单细胞DNA的获得，主要通过多重置换扩增反应（ MDA）完成。在微生物细胞中细菌中几个飞克 (10-15g)的DNA能扩增得到微克(10-6g)的高分子量DNA (Zhang et al, 2006)，扩增得到的DNA 适合DNA文库的构建，MDA生成的DNA也可直接作为模板进行测序。
Stanford的Stephen Quake实验室去年发表了一篇Cell文章（Wang et al 2012）, 是测人类精子的单细胞基因组的，“这项研究第一次绘制了个体重组图谱，也首次发现了来自同一个人的不同精子的不同突变率”。利用的平台是微流控芯片+MDA扩增+ Illumina HiSeq高通量测序的方法；Harvard的谢晓亮实验室发表了一篇Science（Lu et al 2012）该研究“首次实现了高覆盖度的单个精子全基因组测序，构建了迄今为止重组定位精度最高的个人遗传图谱，这一技术方法在男性不育症研究和肿瘤早期诊断及个体化治疗等生物医学领域有着广泛的应用前景”。利用的是微流控芯片MALBAC扩增技术+ Illumina HiSeq高通量测序。这里面的不同就是扩增技术，MDA号称能扩增90%的基因组，但据谢晓亮报道的新的MALBAC技术似乎更优于MDA技术。但是MDA技术比较成熟，Qiagen有比较成熟的试剂盒售卖，不知道MALBAC技术有没有商业化的试剂盒。
完成了这两部之后，就是测序了，现在测序技术日新月异，一日千里。成本也确实降低了不少，在近几年可能会火起来。同时该技术还广泛应用于微生物领域。
单细胞基因组测序的价值
高通量测序技术飞快向前发展，测序价格更是由第一个人类基因组测序成本的30亿美元下降到5000-10,000美元，然而在遗传信息用于医疗诊断和疾病治疗的过程中，科研人员仍面临一个问题，那就是如何通过一个细胞样本测通基因组序列。之前的测序都是忽略细胞间的差异，而对同一组织的大量细胞的测序往往会生成多重数据，这不利于追踪细胞病变过程和细胞间状态差异。面对这一科学困境，以单细胞为样本的测序技术可对细胞内30亿对碱基测序从而拓展了这一领域内的研究。[单细胞测序挑战基因组测序的平均法则]
