基于NGS平台的BRCA检测对医生朋友距离很近又似乎很远：临床实践中检测诉求很明确，但检测过程像个黑匣子玄之又玄，让不少人对检测望而生畏。BRCA基因本身有什么特点？对应于检测有哪些合适的方法？流程有哪些关键步骤？哪些样本可用于检测？遗传解读需要达到什么水平才能保障结果的准确性？为什么体细胞突变检测目前那么少见？今天就来深入八一八，解答BRCA检测中常见的疑惑。
1. BRCA1和BRCA2基因介绍
BRCA1和BRCA2是最早发现的直接与遗传性乳腺癌有关的两个基因。作为抑癌基因，两者在调节细胞复制、DNA损伤修复、细胞的正常生长方面起着重要作用。BRCA1/2基因序列很长。具体来说，BRCA1长81.2kb，由22个编码外显子组成，转录形成5.7kb的mRNA。BRCA2长84.2kb，由26个编码外显子组成，mRNA长为11kb。
根据BIC数据库（Breast Cancer Information Core, https://research.nhgri.nih.gov/bic/），BRCA1和BRCA2基因目前已报道的变异类型包括无义突变、移码突变、非移码插入、非移码缺失、错义突变、同义突变、剪接位点突变，以及大片段的缺失或重排等，涉及到近4000个变异位点，而且这些突变分散遍布于各个外显子，没有证据表明存在突变热点区域，只存在少数几个相对高频的变异位点。若用传统的Sanger测序、qPCR方法或MLPA等对BRCA1/2整个基因进行检测，都不能一次性检测BRCA1和BRCA2基因的所有变异类型，且需要耗费大量的时间并且价格不菲。相比之下，高通量测序技术-二代测序技术以其更为高效快速且能一次性对BRCA1和BRCA2基因所有外显子及邻近上下游区域内的变异同时进行检测，以更高性价比的优势脱颖而出，成为BRCA1/2基因检测市场的主力军。
2. BRCA胚系突变检测流程
利用二代测序技术开展BRCA突变筛查检测，其流程复杂且专业性强（如下图1），对工作人员专业技术能力和检测流程的技术操作、质量控制的要求高。
图1. BRCA胚系突变筛查检测流程
在实验室人员能力方面，专业的技术人员是检测结果准确的重要保障。需要对不同方向的技术人员分别进行专业的临床基因扩增检验能力、生物信息分析能力和遗传解读能力等培训，技术人员获得相应的上岗证和资格证书后方可进行相关操作执行。
在检测流程方面，实验室收到检测样本后，采用标准流程提取基因组DNA。通常有2种方法构建测序文库：一种是利用超声波仪将基因组DNA打断，进行DNA建库。再利用定制探针与标记好的患者DNA文库杂交，杂交结束后进行洗涤和洗脱反应，再经PCR扩增构成测序文库；另一种是设计BRCA基因特异的引物，用多重PCR的方法把BRCA基因上感兴趣的区域扩增，然后进行加接头、纯化等反应，构建测序文库。测序文库质控合格后利用高通量测序仪读出原始测序数据。测序完成后，数据分析流程见下图2。
图2. 信息分析流程
首先对原始数据进行测序质量评估，去除低质量和接头污染的“噪音”数据，然后将得到的无噪声的数据与参考基因组序列进行比对。基于比对结果，进行变异分析。最后，对检测到的变异参考若干数据库及查阅文献进行临床意义解读。
整个检测流程每一个环节都需要设置相应的技术操作规范，严格遵照技术操作程序执行，并开展室内质量控制，参加国家卫生计生委临床检验中心组织的室间质量评价。国家卫生部临床检验中心于2015年10月首次组织开展了全国肿瘤诊断与治疗高通量测序检测室间质量评价测评活动。此次测评活动分胚系突变和体细胞突变两个部分，胚系突变的合格率为84.1%，100%正确的实验室77.3%；体细胞突变的合格率仅51.2%，全对的实验室仅占16.7%。对于现今活跃的肿瘤诊断与治疗高通量测序检测市场，这无疑也敲响了警钟，呼吁整个市场的规范化标准化。
此外，由于整个检测流程繁琐复杂，操作步骤繁多，为保障检测结果的有效性和准确性，有临床意义的位点（致病和疑似致病的突变）都必须经过区别于NGS平台的另一平台（如，Sanger和/或qPCR等）进行验证。在经历了二十几步严格质量把控环节后，一份完整由专业解读人员撰写的BRCA基因检测报告才会到达医生手中，为患者提供准确的基因参考信息。
介绍完BRCA基因检测的整体流程，下面我们着重针对医生朋友需要接触到的两个环节，样品收集和报告解读进行介绍。
3. 样品收集
BRCA基因检测的过程中，最基本的要素是样本的可靠性。只有从最初保证样本质量以及准确的临床资料，才能获得最为精准的基因检测结果。下面详述BRCA基因检测采样时的注意事项。
首先，医生需要与患者充分沟通，在患者充分理解基因检测的价值、必要性并认可基因检测的情况下，方可进行进一步的填写表单（包括申请单与知情同意书）以及采样。申请单必须要包括受检者姓名、年龄、性别、民族、籍贯、个人疾病史、家族疾病史等，以避免后期样本混淆的可能，同时对于部分特殊、具有家族史的成员，出现较罕见的基因突变时信息也便于及时反馈给送样医生，为患者提供更为严格准确的检测结果以及更为科学的进一步治疗方案。知情同意书的意义在于给患者更为详实的检测介绍，进一步理解基因检测的内容与意义，规避可能存在的伦理风险。
其次，采样流程。过程包括样本采集与样本标记。BRCA基因检测多采用外周血样本采集，少数会提供唾液、DNA样品。
对于采集后的样本，在采集管上贴上样本唯一条码，并注明受检者姓名、年龄等信息；样本交接单上必须标有受检者姓名或入库编号、采样日期，确保信息与申请单一致，以避免不必要的混淆可能。为保证运输过程样品的保护，请选择专业的物流机构并严格按照要求完成。
4. 遗传报告解读流程
遗传报告解读也具有一套严格的流程。原则上均以美国医学遗传学与基因组学学院（ACMG）颁布的基因变异解读和指南为解读标准，首先利用公共和本地突变数据库对变异频率进行过滤。经过对功能预测分析软件结果、数据库记录、文献研究报道综合考虑，并结合临床表型，专业遗传报告解读人员会做出数据分析和解读。遗传分析解读最终需要对筛选出来的突变进行判定，按照美国国立卫生院NIH的分类标准，遗传性肿瘤易感突变分为五类，致病突变、疑似致病突变、意义未明突变、疑似良性突变及良性多态性。解读报告除了对突变进行健康等级分类外，也会为医生及患者提供FDA批准上市针对BRCA突变靶向药物相关的信息（如针对BRCA基因突变的晚期卵巢癌患者治疗，FDA批准上市的阿斯利康的奥拉帕利（Olaparib, 商品名 Lynparza）。严格的标准化解读流程以及具有资质的专业遗传信息解读人员都是遗传报告解读必不可少的部分，解读人员需要具备遗传学、医学或药学专业背景，并且经过专业的遗传信息解读培训以及实际解读经验，才能胜任这一工作。
5. BRCA体细胞突变检测现况
在乳腺癌、卵巢癌中检测到的BRCA 1/2 突变，其中20%左右是由于体突变引起。体细胞突变的检测需要正常组织做对照，常用血细胞做对照（如TCGA 癌症研究）。研究发现，体细胞突变与胚系突变的卵巢癌，乳腺癌病人在生存、预后方面没有明显的差异，并且都可以用奥拉帕利进行治疗。但是相对于胚系突变，体细胞突变检测难度大些。检测的难度和准确性主要受样本类型、癌症细胞含量以及突变比例（具有BRCA 1/2 体细胞突变的癌细胞占所有癌细胞的比例）等影响。因此，针对BRCA基因体细胞突变的检测技术还在完善中。
供稿人员：华大基因高爽、李世勇、李红梅、曾宪一
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