为了更清楚地了解细胞内正在发生的事件，科学家们需要知道数以千计蛋白质和其他分子的定位。麻省理工学院的化学家们现在开发了一项新技术，可以标记细胞某一特定区域中所有的蛋白质，从而更准确地绘制这些蛋白质的图像。
领导这一研究的是著名华裔女科学家、化学副教授Alice Ting，她曾师从诺贝尔获得者钱永健，因为在标记和观测活细胞内特异蛋白上所采用的创新技术而曾获得多个行业大奖，包括NIH“院长先锋奖”。
在这篇发表于1月31日《科学》（Science）杂志上的论文中，Ting和同事们利用这一新技术鉴别了定位在线粒体基质上的近500个蛋白质。
Ting说：“能够获得活细胞时空分辨分子图像，这是生物学的一个圣杯。我们离这一目标仍然很远，但我们最主要的动机还是为了更接近于这一目标。”
Ting与来自Broad研究所和哈佛大学医学院的研究人员共同开发的这项新技术，结合了现有两种技术——显微镜成像和质谱法的力量，标记了细胞特异区域中的蛋白质，生成了一张该区域中所有蛋白质的综合列表。
蛋白标记
利用荧光显微镜或电子显微镜，科学家们可以高分辨率确定蛋白质定位，但一次只能对少量细胞的约2万个蛋白进行成像。Ting说：“这是一个容量问题。你当然不能在单细胞中一次对蛋白质组中的所有蛋白质成像，因为没有办法从光谱上分开大量信号通道。”
利用质谱法，通过电离检测化合物的质量和化学结构，科学家们可以在一次实验中分析单个细胞的整个蛋白质组成。然而，这一过程需要溶解细胞膜释放细胞内容物，它将所有蛋白质混杂到了一起。通过纯化这些混合物，并提取特异的细胞器，就有可能弄清这些细胞器中的蛋白质，但这一过程很麻烦，且常常是不可靠的。
新方法则是在质谱法之前先标记活细胞中的蛋白质，从而在细胞裂解之前先获得了空间信息。随后在分析过程中通过注释携带定位标记的蛋白，对这一信息进行重建。
新系统利用了一种生物素（biotin）化学标记。为了用生物素标记蛋白质，研究人员首先设计出了一种命名为“APEX”的新酶。该酶是一种过氧化物酶。
每种过氧化物酶都具有不同的底物，生物素酚（biotin-phenol ）是APEX的一种底物。当研究人员将生物素酚添加到表达APEX的工程细胞上时，该酶生成了生物素-苯氧自由基(phenoxyl radical)——带有不成对电子的高活性分子。这些自由基迅速抓取附近的蛋白质，用生物素对它们进行标记。
为了确定生物素是细胞中特异区域唯一的标记蛋白，研究人员设计APEX，使得它只与定位于目的区域的某一蛋白质或肽结合。一旦处于正确的位点，APEX酶就会在最初目标的短距离内标记所有其他的蛋白质。
Ting说，标记蛋白质之后的过程便非常的常规。溶解细胞，提取生物素标记蛋白质，利用质谱法鉴定这些蛋白质。
“你所做的就是在活细胞中用生物素标记这些蛋白质，然后你只需抽提出这些蛋白质。因此，你可以绕过与纯化蛋白质区域和细胞器相关的所有问题，因为你再也不需要这样做，”Ting说。
综合列表
为了证明这一技术的效力，研究人员生成了线粒体基质上蛋白质的综合列表。细胞的大部分能量均是在线粒体中生成，许多的生物合成过程也在这一细胞器中发生。
利用这一新方法，研究小组鉴别了线粒体基质中近500个蛋白质。以前，研究人员曾尝试通过抽提这一细胞区室，然后进行质谱分析，生成了仅37个蛋白质的列表。“从前并没有线粒体基质亚区的高质量图谱，而现在我们获得了一个，”Ting说。她补充说道，这一新的信息资源应该有助于生物学家们了解更多关于其中大量蛋白质功能的信息。
该研究小组现发现，与血红素合成有关的PPOX酶并非如生物学家曾认为的那样定位。当血红素前体通过生物合成途径时，它们穿梭到了细胞的不同部位。在线粒体基质中发现PPOX表明：一定是有未知的转运蛋白将血红素前体带到了基质。
她说：“重定位将使得人们不得不重新思考这些生物合成途径，以及中间体移动的机制。现在基于我们数据，将不得不改写对这条途径的分子理解。”
现在，研究人员正在调查存在于线粒体另一区室——膜间隙中的蛋白质。他们也修改了标记系统的化学物，以便他们能利用利用它来完成其他任务，例如绘制膜蛋白的表面结构图谱，检测特异蛋白质间的相互作用。
Proteomic Mapping of Mitochondria in Living Cells via Spatially Restricted Enzymatic Tagging
Rhee HW, Zou P, Udeshi ND, Martell JD, Mootha VK, Carr SA, Ting AY.
Microscopy and mass spectrometry (MS) are complementary techniques: the former provides spatiotemporal information in living cells, but only for a handful of recombinant proteins, while the latter can detect thousands of endogenous proteins simultaneously, but only in lysed samples. Here, we introduce technology that combines these strengths by offering spatially and temporally resolved proteomic maps of endogenous proteins within living cells. The method relies on a genetically targetable peroxidase enzyme that biotinylates nearby proteins, which are subsequently purified and identified by MS. We used this approach to identify 495 proteins within the human mitochondrial matrix, including 31 not previously linked to mitochondria. The labeling was exceptionally specific and distinguished between inner membrane proteins facing the matrix versus the intermembrane space (IMS). Several proteins previously thought to reside in the IMS or outer membrane, including protoporphyrinogen oxidase, were reassigned to the matrix. The specificity of live-cell peroxidase-mediated proteomic mapping combined with its ease of use offers biologists a powerful tool for understanding the molecular composition of living cells.
文献链接： Proteomic Mapping of Mitochondria in Living Cells via Spatially Restricted Enzymatic Tagging
