人事有代谢，往来成古今，历史进程中充满了旧事物的消亡，而在多细胞生物生命维持的过程中也充满着死亡，但不同的是，这些发育、免疫过程中不再需要的细胞，或者是受损、异常的细胞通常以一种主动的、高度调控方式走向死亡，即程序性细胞死亡（Programmed Cell Death，PCD）。
PCD的重要性尤其体现在当它不能正常运作时，比如异常、受损或受感染的细胞如不能正常清除，则可能会累积并形成肿瘤。反之，利用好PCD则可以开辟出新的治疗手段，如使用诱导铁死亡（Ferroptosis）的药物，能有效破坏并清除肿瘤。
生物学家一直对弄清楚PCD背后的机制充满兴趣。最早由德国自然科学家Karl Vogt于1842年观察和报道的PCD形式之一——细胞凋亡（apoptosis）表现为细胞收缩、核染色质凝聚、细胞膜外翻和断裂以及之后被巨噬细胞吞噬等等，被比喻成一种“悄无声息的散场”。而相比之下，另外两种被研究得较多的PCD形式——细胞焦亡（pyroptosis）和坏死性凋亡（necroptosis），则更像发生了一场“爆炸”，细胞质膜破裂，细胞内容物渗出，并可能引发持续甚至激烈的炎症反应。
在这种情况下，细胞质中的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMP）等蛋白质会从细胞中逸出。DAMP是一类内源性危险信号，一旦出现在胞外，就可以激活和调节免疫系统的反应，促进炎症反应和组织修复。
过去的观点认为，PCD过程中出现的细胞质膜破裂（Plasma membrane rupture，PMR）是一个由渗透压变化引起的被动过程。比如在细胞焦亡中，成孔蛋白GSDMD首先聚集在质膜中形成小口径的孔隙，释放出IL-1β等促炎细胞因子，随后由于渗透压差，细胞发生肿胀，最终质膜破裂，释放出LDH和DAMP等较大的分子。
然而，这一观点在21年被基因泰克公司生理化学系Nobuhiko Kayagaki等研究人员推翻。他们在发表在Nature上的“NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death”一文中指出，在细胞焦亡中，质膜破裂及LDH和DAMP的释放需要一种名为NINJ1的蛋白参与，如果该蛋白发生突变，则PMR不会发生，且NINJ1介导的PMR和DAMP释放独立于GSDMD。
图1 Kayagaki团队推翻了PMR被动发生的观点（图源：[1]）
NINJ1（Nerve Injury-induced Protein 1）是一种小型跨膜蛋白，最初被认为是一种神经损伤后产生的粘附分子。因此，发现NINJ1在质膜破裂中扮演关键角色不仅令人意外而且意义重大。不过，在21年的这项研究中，Kayagaki团队主要通过正向遗传筛选的方法确认了NINJ1和质膜破裂之间的联系，并推测出NINJ1通过寡聚化来诱导质膜破裂。至于NINJ1在质膜破裂中的具体作用以及其功能的分子机制并不完全清楚。
5月17日，瑞士巴塞尔大学生物中心博士生Morris Degen及其同事在Nature上发表的“Structural basis of NINJ1-mediated plasma membrane rupture in cell death”一文则回答了这个问题。
图2 研究成果（图源：[2]）
Degen等人使用交联技术揭示，NINJ1寡聚化发生在GSDMD孔形成后，NINJ1寡聚体形成的同时，发生LDH的释放。使用荧光蛋白标记NINJ1，Degen等人观察到，在细胞焦亡过程中，NINJ1在细胞膜上形成簇集。随机光学重建显微镜的观察显示，NINJ1簇集成长为长度较长、高度分枝的丝状结构和大型的环状结构，有些丝状结构甚至可以达到微米尺度。
图3 NINJ1蛋白组装（绿色/黄色）成丝状结构并使细胞膜（灰色）开孔，直到细胞完全分解。细胞内成分以蓝色显示。（图源：[3]）
使用近原子水平分辨率的单粒子冷冻电镜技术（single-particle cryo-electron microscopy）观察体外生成的NINJ1寡聚形式，Degen等人发现，NINJ1丝状体中基本重复单元由四个α-螺旋结构组成。C端的两个疏水性跨膜α螺旋（α3和α4）排列在一起构成丝状结构的主体，N端的α2与α3、α4相接，α1则与α2形成特定的角度，并与相邻NINJ1蛋白相连。
图4 NINJ1蛋白的结构、寡聚体的形成以及寡聚化能被NINJ1抗体阻断（图源：[4]）
Alphafold成功预测了α2、α3和α4的分子排列，但并未预测出α1在驱动NINJ1自组装中所起到的关键分子相互作用。这表明结构生物学中实验方法仍然是十分必要的。
Degen等人这样解释NINJ1的破膜机制。他们观察到，α1和α2具有一个亲水面和一个疏水面。在NINJ1为寡聚化的正常细胞中，α1和α2处于胞外环境。然而，当程序性细胞死亡启动，α1和α2会插入质膜中，通过α3、α4、相邻α1疏水面之间的相互作用驱动NINJ1寡聚化。通过将α1和α2的亲水面引入疏水膜，这种结构会破坏膜的完整性并形成孔洞。Degen等人之后对NINJ1突变体的全面分析和分子建模研究支持了这一理论。
图5 NINJ1在质膜上组装成篱笆样结构使质膜开孔并释放出LDH和DAMP（图源：[4]）
同日，Kayagaki等人在Nature发表了另一篇关于NINJ1蛋白的研究“Inhibiting membrane rupture with NINJ1 antibodies limits tissue injury”。该研究延续了团队两年前的工作，并证实了之前论文提出的设想，即使用NINJ1抗体可以抑制程序性细胞死亡的质膜破裂。
图6 研究成果（图源：[5]）
文中，Kayagaki等人报道了他们开发的一种名为D1的强效抗-NINJ1抗体。该抗体能够阻断了NINJ1的寡聚化并防止细胞在焦亡和凋亡情况下破裂。通过细胞研究和检查与肝炎相关的细胞死亡的小鼠模型，Kayagaki等人表明，无论是删除NINJ1基因还是通过D1抗体抑制NINJ1，相比NINJ1具有正常功能的细胞，细胞膜破裂以及LDH和DAMP的释放均减少了。
Kayagaki等人定位了NINJ1上与D1抗体结合的区域，该区域位于C端末端，是一个无法在冷冻电镜结构中捕捉到的柔性区域。此前，NINJ1的N端和C端均通过突变研究证明不是质膜破裂所必需的。Kayagaki等人认为，D1抗体是通过阻断NINJ1蛋白的自组装来阻止NINJ1的寡聚化。
这两项研究揭示了NINJ1如何在程序性细胞死亡的最后阶段确保细胞膜完全破裂并释放DAMP。但仍有许多问题留待以后的解答。比如，如何整合和控制不同类型的程序性细胞死亡以实现DAMP的最佳释放？触发NINJ1在质膜上开孔的机制是什么？以及NINJ1是否可能成为某些慢性炎症疾病的治疗靶点等。
参考资料：
[1]Kayagaki, N., Kornfeld, O.S., Lee, B.L. et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature 591, 131–136 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03218-7
[2]Degen, M., Santos, J.C., Pluhackova, K. et al. Structural basis of NINJ1-mediated plasma membrane rupture in cell death. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05991-z
[3]https://www.unibas.ch/en/News-Events/News/Uni-Research/Under-control-to-the-very-end---how-our-cells-kill-themselves.html
[4]https://www.nature.com/articles/d41586-023-01602-z
[5]Kayagaki, N., Stowe, I.B., Alegre, K. et al. Inhibiting membrane rupture with NINJ1 antibodies limits tissue injury. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06191-5
