2012年2月，FDA发布了期待已久的生物仿制药指导文件草案[1-3]，这三个文件概述了FDA在审批高相似性仿制药时所考虑的必要程序和要求，严格对仿制药进行类似特征的分析处于审批的核心位置，这一首要步骤表明仿制药与参照专利药高度的相似性。根据草案的指导，在仿制药和创新药之间进行更为广泛、强大的结构与功能方面的对比分析，该结构特征决定了在审批时需要怎样的临床与非临床研究。[1]
仿制药指纹：生物分析法寻找其结构特征
寻找指纹
FDA指导草案的一个重要特征是识别一种蛋白质的“指纹”，通过相似性组合方法测量一系列结构属性，进而确定仿制药与专利药之间的相似性。在某种程度上，这一概念源自于依诺肝素(抗凝血药)获得审批的经历，在2010年7月这一低分子量的肝素在没有临床试验的情况下获得审批。根据五个标准，FDA认为其具有与Lovenox相似的活性成分[4]，列举如下：
• 依诺肝素的物、化特性
• 依诺肝素的性质和化学裂解过程
• 依诺肝素成分的性质和排布
• 实验室测量的依诺肝素抗凝血活性
• 药物对人类作用的某些效果
虽然依诺肝素不是一种蛋白质，但是它是一种复杂的生物产品，在理化水平上，它的特征更像重组蛋白产品。
指南草案表明，指纹信息会超过全部蛋白质产品的基本信息（参见附文“蛋白质品质属性”）。FDA表示，“这可能是有用的：通过使用指纹样的分析算法（包括大量的附加属性以及高灵敏性的组合），研究人员在递交的与参照的产品之间进行品质属性的差异对比。[3]”FDA没有定义这类蛋白质的特定属性以及使用方法，从一方面看，这是因为蛋白质产品在特征上具有极大的多样性。
Fiona M. Greer 称：“指纹将取决于单个分子以及关键品质的相关属性，这可能用于规范一类特定的分子，而不是一类产品。例如，糖对于一类分子的功效具有重要作用，而在另一类分子中可能不重要。标准属性应该包括物理化学（初级和较高级的有序结构）和生物学的特性。毫无疑问，该整合信息对于转录后修饰是需要的。”
指纹对比技术需要不断改进。尽管真实指纹具有独特性和不变性，然而很难控制蛋白质的属性。从蛋白产品来看，翻译修饰后的改变对于蛋白质生物活性的重要作用具有不确定性，对于培养的细胞，蛋白质的异质特征是可预料的，而生物制品的审核过程涉及到与监管机构的讨论：分段定义异质性以及不受影响的产品效力和安全性。
对于仿制药制造商而言，关键的一环是识别蛋白质产品的变异程度，这一步骤涉及在不同时间段获得的多批次产品和在多个方面评估其可行的上架期限，以及确定产品表现的一系列品质属性。
马萨诸塞州生物制造中心蛋白质科学部门主任Jin Xu说，“我不会建议挑选一个批次，并试图制造相似性高达99%的蛋白质，这类比对蛋白质将表现出一系列可接受的理化性质，生物仿制药也属于这一范围。”
翻译后修饰
糖基化能够解释蛋白质较大的异质性，这取决于蛋白质糖基化的水平。糖单位连接到任一蛋白质的糖基化位点上，其取决于宿主细胞类型（来自于动物、植物和微生物）。针对这一原因，FDA建议使用同种类型的细胞生产生物仿制药，然而，即使在同一种培养的单细胞中相同的肽链也会出现不同的糖链结构。
由于糖基化对于蛋白质的功效、稳定性或免疫原性可能具有重要作用，因此，它作为一个参数需要很好地定义和控制。最起码确定的是蛋白质中碳水化合物含量（中性糖、氨基糖及唾液酸）、糖链结构、寡糖模式（支链剖面）以及多肽链的糖基化位点。
Pauline Rudd 称：“聚糖在空间上具有多维度，研究人员可在一个水平上分析抗原表位，或进行详细的分析，这取决于蛋白质的关键功能。FDA感兴趣的是糖基化多样性，它可能引起人体免疫原性。例如，植物源性蛋白中的木糖和岩藻糖。
Rudd解释道，虽然聚糖表现出许多生物产品的关键功能，但是它们不是万能的。大约存在200个潜在的翻译后修饰，包括C-末端剪切、二硫键的形成、糖基化和脱酰胺。二硫键在正确折叠蛋白质三维结构中发挥重要作用，但是半胱氨酸残基有时出现错配，从而使得二硫键不正确地形成。他认为，研究人员需要越来越多的高级水平的结构分析（即三维结构分析）。
正交和重叠技术
当开发一个生物仿制药，对理化性质的界定不仅要确定原创药的完整序列和转录后修饰，还要评估产品的品质属性和纯度。原创药和仿制药之间侧端的比较将需要来自不同技术的数据，它们用于反映两种分子的主体结构和高度有序的结构。关于选取适当分析方法的指导方针可参考ICH Q6B[5]。单一方法可提供多种蛋白质属性的信息，例如，丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）可提供关于体积、聚集体以及二硫键变异体的信息，而等电聚焦能提供同种型的信息，后者可反映糖基化或脱酰胺的差异。
准确的特征策略取决于单个分子，同时还借助可比较分子大小、电荷以及结构的方法，其中质谱法（MS）是一种用处广泛和重要的方法，其可提供关于完整分子量，结构确认（通过大规模的测绘技术）、异质性和翻译后修饰（包括糖基化）的信息。
过程和产品
对于生物制剂，影响最终产品的因素有很多，如合成蛋白质的细胞类型、细胞培养的特定条件、以及下游加工的方法。近来，细胞培养条件对糖基化影响的研究发现，几乎所用的细胞培养条件都具有效果，包括细胞培养基的成分、溶解氧浓度、生物反应器pH值、二氧化碳分压、温度、剪切应力以及生产模式（即补料与灌注）[6]。规模扩大也可以影响产品的糖基化，在工艺开发和规模扩大时需要控制多项特征参数。首先确定糖基化属性对于蛋白质功能起到至关重要的作用，然后选择这些属性最佳的检测方法，而不是尝试漫无目的方法以简化流程[7]。
比看起来的困难
虽然仿制药可能比原创药较容易，但是工程化生产特定仿制药的难度不能被低估。Rudd指出，，生产原创药要比简单得将DNA插入到细胞系中要困难得多，研究人员期待原创药能够被忠实地复制。对于生物制剂，最终产品与生物进程紧密相关，但是生物仿制药制造商却不知道原创药的这些过程。
EMA是美国生物仿制药的领头羊，在2006年获取第一个批准的生物仿制药，目前已有14个生物仿制药投放到市场上。EMA发布指导文件以针对不同的产品类型（包括epoetins、filgastrims），以及提供关于单克隆抗体的指导草案[8-10]。此类产品的具体规格无疑能够及时获得FDA审批，并有助于更好地界定指纹的模型。
1. FDA, Draft Guidance, Scientific Considerations in Demonstrating Bioimilarity to a Reference Product (Rockville, MD, February 2012).
2. FDA, Draft Guidance, Quality Considerations in Demonstrating Bioimilarity to a Reference Product (Rockville, MD, February 2012).
3. FDA, Guidance for Industry on Biosimilars: Q & As Regarding Implementation of the BPCI Act of 2009 (Rockville, MD, February 2012).
4. FDA, Generic Enoxaparin Questions and Answers, www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforPatientsandProviders/ucm220037.htm, accessed May 2012.
5. ICH, Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for. Biotechnological/Biological Products (1999).
6. P. Hossler, SF Khattak, and ZJ Li, Glycobiol.19 (9), 936–949 (2009).
7. D. Fernandes, BioPharm Intl. 24 (1) (2011).
8. EMA, Guidance on Similar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins (Sept. 2010).
9 . EMA, Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Granulocyte-Colony Stimulating Factor (June 2006).
10. EMA, Draft Guideline, Similar Biological Medicinal Products Containing Monoclonal Antibodies (Sept. 2010).
