1. 为什么要把circRNA作为潜在的biomarker分子？
最近的研究表明，生命体中除了线性的RNA分子，还大量存在着一类闭合环状的RNA分子，他们在个体发育，不同组织内，疾病组织中都特异性的表达。通过二代测序鉴定，这些circRNA分子通常由蛋白编码基因的2个——4个的外显子部分，通过前面外显子的5’端与后面外显子的3’端互补结合环化而来。由于circRNA的环状封闭的特性，导致了它可以逃避核酸外切酶的作用，因此，circRNA在细胞中可以长期稳定存在，也正是因为它的稳定性，很容易让我们联想到circRNA是否可以作为临床诊断的潜在biomarker分子。该研究就是通过检测全血中的circRNA来研究circRNA是否可以作为未来疾病诊断的biomarker。
2. 全血样本能检测到稳定存在的circRNA吗？
研究人员首先用临床全血样本提取了总RNA，然后消化核糖体RNA，用随机引物进行反转录后进行测序建库。通过对两个志愿者的RNA样本进行测序分析，鉴定到4550个和4105个特异的circRNA分子至少有2个独立的reads。把两个样本的数据进行比较分析发现样本间的circRNA表达correlation很高（R=0.8）,有1265个共有circRNAs（55%）reads数超过5，有2442个共有circRNAs（39%）reads数超过2，技术重复实验也证明检测重复性比较高。
为了验证从血液检测到的circRNAs的可靠性，研究人员将检测到的circRNAs与ENCODE project数据库来源的小脑，神经组织的circRNAs结果和肝组织的结果进行了比较分析。结果显示，血液中的circRNAs比小脑和肝中的circRNAs表达更高。
通过对circRNAs的来源分析，研究人员发现大部分的circRNAs来源于编码基因的外显子区域和5’UTR区域。另外，这些来源编码基因的circRNAs表达和对应的mRNA表达存在着显著的相关性。
对circRNAs的剪切长度分析显示，在血液中的circRNAs长度与在肝和小脑中检测到的circRNAs长度一致，集中在200-800nt(median=343nt)。值得注意的是，有些基因可以产生多个circRNAs分子，其中，有23个基因每个可以产生超过10个circRNAs。
3. 全血样本测序得到的circRNAs可靠吗？
为了验证测序所得得circRNAs分子的可靠性，研究人员对表达高的8个circRNAs和其线性mRNA分子进行qPCR验证，发现有7个检测结果是一致的。研究人员对这7个circRNAs进行了深入分析：1）核酸外切酶抵抗力检测；2）Sanger测序确认序列信息。结果显示7个分子的验证结果整体错误率很低。
4. 血液来源circRNA分子是否普遍存在？
对血液中检测到的circRNAs分子和线性mRNA进行对比分析后发现，circRNAs分子通常比其临近的线性RNA分子表达更高。比如，PCNT基因来源的circRNA表达在全血样本中是其线性RNA表达值的30倍以上，而在细胞系HEK293中却没有。
另外，在全血中筛选到的circRNAs有部分在小脑和肝中表达，但是也存在很多特异表达的circRNAs。很多在血液中表达的circRNAs分子表达相比组织中更高，更稳定。
结论
综上所述，研究人员通过对全血样本进行circRNAs检测，与组织中检测到的circRNAs进行比较和验证分析，表明从血液样本检测circRNAs分子是稳定和易于检测的，可以作为未来疾病诊断的潜在biomarker分子。
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备注：本文内容由微信公众号“个体化诊疗”编译。
