探明关键蛋白如何完成程序性细胞死亡最后一步,使用抗体则可阻断该过程!

2023-06-08 09:13 · 生物探索

发育、免疫过程中不再需要的细胞,或者是受损、异常的细胞通常以一种主动的、高度调控方式走向死亡,即程序性细胞死亡(Programmed Cell Death,PCD)。

人事有代谢,往来成古今,历史进程中充满了旧事物的消亡,而在多细胞生物生命维持的过程中也充满着死亡,但不同的是,这些发育、免疫过程中不再需要的细胞,或者是受损、异常的细胞通常以一种主动的、高度调控方式走向死亡,即程序性细胞死亡(Programmed Cell Death,PCD)。

PCD的重要性尤其体现在当它不能正常运作时,比如异常、受损或受感染的细胞如不能正常清除,则可能会累积并形成肿瘤。反之,利用好PCD则可以开辟出新的治疗手段,如使用诱导铁死亡(Ferroptosis)的药物,能有效破坏并清除肿瘤。

生物学家一直对弄清楚PCD背后的机制充满兴趣。最早由德国自然科学家Karl Vogt于1842年观察和报道的PCD形式之一——细胞凋亡(apoptosis)表现为细胞收缩、核染色质凝聚、细胞膜外翻和断裂以及之后被巨噬细胞吞噬等等,被比喻成一种“悄无声息的散场”。而相比之下,另外两种被研究得较多的PCD形式——细胞焦亡(pyroptosis)和坏死性凋亡(necroptosis),则更像发生了一场“爆炸”,细胞质膜破裂,细胞内容物渗出,并可能引发持续甚至激烈的炎症反应。

在这种情况下,细胞质中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMP)等蛋白质会从细胞中逸出。DAMP是一类内源性危险信号,一旦出现在胞外,就可以激活和调节免疫系统的反应,促进炎症反应和组织修复。

过去的观点认为,PCD过程中出现的细胞质膜破裂(Plasma membrane rupture,PMR)是一个由渗透压变化引起的被动过程。比如在细胞焦亡中,成孔蛋白GSDMD首先聚集在质膜中形成小口径的孔隙,释放出IL-1β等促炎细胞因子,随后由于渗透压差,细胞发生肿胀,最终质膜破裂,释放出LDH和DAMP等较大的分子。

然而,这一观点在21年被基因泰克公司生理化学系Nobuhiko Kayagaki等研究人员推翻。他们在发表在Nature上的“NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death”一文中指出,在细胞焦亡中,质膜破裂及LDH和DAMP的释放需要一种名为NINJ1的蛋白参与,如果该蛋白发生突变,则PMR不会发生,且NINJ1介导的PMR和DAMP释放独立于GSDMD。

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图1 Kayagaki团队推翻了PMR被动发生的观点(图源:[1])

NINJ1(Nerve Injury-induced Protein 1)是一种小型跨膜蛋白,最初被认为是一种神经损伤后产生的粘附分子。因此,发现NINJ1在质膜破裂中扮演关键角色不仅令人意外而且意义重大。不过,在21年的这项研究中,Kayagaki团队主要通过正向遗传筛选的方法确认了NINJ1和质膜破裂之间的联系,并推测出NINJ1通过寡聚化来诱导质膜破裂。至于NINJ1在质膜破裂中的具体作用以及其功能的分子机制并不完全清楚。

5月17日,瑞士巴塞尔大学生物中心博士生Morris Degen及其同事在Nature上发表的“Structural basis of NINJ1-mediated plasma membrane rupture in cell death”一文则回答了这个问题。

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图2 研究成果(图源:[2])

Degen等人使用交联技术揭示,NINJ1寡聚化发生在GSDMD孔形成后,NINJ1寡聚体形成的同时,发生LDH的释放。使用荧光蛋白标记NINJ1,Degen等人观察到,在细胞焦亡过程中,NINJ1在细胞膜上形成簇集。随机光学重建显微镜的观察显示,NINJ1簇集成长为长度较长、高度分枝的丝状结构和大型的环状结构,有些丝状结构甚至可以达到微米尺度。

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图3 NINJ1蛋白组装(绿色/黄色)成丝状结构并使细胞膜(灰色)开孔,直到细胞完全分解。细胞内成分以蓝色显示。(图源:[3])

使用近原子水平分辨率的单粒子冷冻电镜技术(single-particle cryo-electron microscopy)观察体外生成的NINJ1寡聚形式,Degen等人发现,NINJ1丝状体中基本重复单元由四个α-螺旋结构组成。C端的两个疏水性跨膜α螺旋(α3和α4)排列在一起构成丝状结构的主体,N端的α2与α3、α4相接,α1则与α2形成特定的角度,并与相邻NINJ1蛋白相连。

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图4 NINJ1蛋白的结构、寡聚体的形成以及寡聚化能被NINJ1抗体阻断(图源:[4])

Alphafold成功预测了α2、α3和α4的分子排列,但并未预测出α1在驱动NINJ1自组装中所起到的关键分子相互作用。这表明结构生物学中实验方法仍然是十分必要的。

Degen等人这样解释NINJ1的破膜机制。他们观察到,α1和α2具有一个亲水面和一个疏水面。在NINJ1为寡聚化的正常细胞中,α1和α2处于胞外环境。然而,当程序性细胞死亡启动,α1和α2会插入质膜中,通过α3、α4、相邻α1疏水面之间的相互作用驱动NINJ1寡聚化。通过将α1和α2的亲水面引入疏水膜,这种结构会破坏膜的完整性并形成孔洞。Degen等人之后对NINJ1突变体的全面分析和分子建模研究支持了这一理论。

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图5 NINJ1在质膜上组装成篱笆样结构使质膜开孔并释放出LDH和DAMP(图源:[4])

同日,Kayagaki等人在Nature发表了另一篇关于NINJ1蛋白的研究“Inhibiting membrane rupture with NINJ1 antibodies limits tissue injury”。该研究延续了团队两年前的工作,并证实了之前论文提出的设想,即使用NINJ1抗体可以抑制程序性细胞死亡的质膜破裂。

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图6 研究成果(图源:[5])

文中,Kayagaki等人报道了他们开发的一种名为D1的强效抗-NINJ1抗体。该抗体能够阻断了NINJ1的寡聚化并防止细胞在焦亡和凋亡情况下破裂。通过细胞研究和检查与肝炎相关的细胞死亡的小鼠模型,Kayagaki等人表明,无论是删除NINJ1基因还是通过D1抗体抑制NINJ1,相比NINJ1具有正常功能的细胞,细胞膜破裂以及LDH和DAMP的释放均减少了。

Kayagaki等人定位了NINJ1上与D1抗体结合的区域,该区域位于C端末端,是一个无法在冷冻电镜结构中捕捉到的柔性区域。此前,NINJ1的N端和C端均通过突变研究证明不是质膜破裂所必需的。Kayagaki等人认为,D1抗体是通过阻断NINJ1蛋白的自组装来阻止NINJ1的寡聚化。

这两项研究揭示了NINJ1如何在程序性细胞死亡的最后阶段确保细胞膜完全破裂并释放DAMP。但仍有许多问题留待以后的解答。比如,如何整合和控制不同类型的程序性细胞死亡以实现DAMP的最佳释放?触发NINJ1在质膜上开孔的机制是什么?以及NINJ1是否可能成为某些慢性炎症疾病的治疗靶点等。

参考资料:

[1]Kayagaki, N., Kornfeld, O.S., Lee, B.L. et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature 591, 131–136 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03218-7

[2]Degen, M., Santos, J.C., Pluhackova, K. et al. Structural basis of NINJ1-mediated plasma membrane rupture in cell death. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05991-z

[3]https://www.unibas.ch/en/News-Events/News/Uni-Research/Under-control-to-the-very-end---how-our-cells-kill-themselves.html

[4]https://www.nature.com/articles/d41586-023-01602-z

[5]Kayagaki, N., Stowe, I.B., Alegre, K. et al. Inhibiting membrane rupture with NINJ1 antibodies limits tissue injury. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06191-5