本文转载自“丁香学术”公众号。
据最新研究数据表明，人类肢体缺失的发生率预计将在未来30年里大幅增加，每年约可影响 360万人，如糖尿病患者、退伍军人、创伤幸存者和周围动脉疾病患者等。尽管发育和再生医学领域已经取得了非常大的进展，但让整个复杂器官成功再生这一目标仍然难以实现。目前，临床医生仍然缺乏有效的手段来促进组织的恢复或逆转组织损失。
包括蝾螈、海星、螃蟹和蜥蜴在内的许多生物至少有部分肢体可以完全再生，扁虫甚至可以被切成碎片，每一块都可以重建为一个完整的有机体。人类的肝脏在损失50%后，具有惊人的、几乎像扁虫一样的再生能力，几乎可以恢复到原来的大小，但通过自然再生来恢复动物肢体功能的可能性仍然遥不可及。
2022年1月26日，来自美国塔夫茨大学等单位的科学家们在Science Advances发表了题为“Acute multidrug delivery via a wearable bioreactor facilitates long-term limb regeneration and functional recovery in adult Xenopus laevis”的文章，他们的研究发现不可再生的成年非洲爪蟾可以被一个短暂的生物反应器诱导到一个持续的再生状态，使其潜在的再生能力被恢复，以再生和重塑失去的肢体。
再生的组织由皮肤、骨骼、脉管系统和神经组成，其复杂性和感觉运动能力远远超过未经治疗的动物。此外，这种诱导方法不需要基因治疗或干细胞植入，同时还会产生分子、细胞和组织水平的变化，从而恢复肢体形态和感觉运动功能，这使得我们离再生医学的目标更近了一步。
图1. 研究成果（图源：Science Advances）
五种药物联合方案可诱导截肢后骨再生
首先，研究人员将成年非洲爪蟾的后肢进行截肢，并安装了被称为BioDome的丝水凝胶装置，该装置包含单独的丝水凝胶（BD）或五种促再生化合物（BDNF、1,4-DPCA、RD5、GH 和 RA）的水凝胶，后者统称为MDT（Multidrug Treatment, 多药物治疗）。对照组动物被截肢并返回生长室而不进行治疗（Not treatment, ND）。24小时后，设备被移除，动物在没有进一步干预的情况下持续长达18个月，研究人员定期评估后肢的再生情况。
在18个月的再生周期中，所有组别的再生软组织长度都有所增加，但与其他组相比，多药物治疗的动物显示出更大、更复杂的软组织生长。这种软组织生长的显著增加最早于截肢后2周被观察到，并且这种优势一直持续到最后。这些数据表明，在截肢部位局部应用MDT可以诱导更大、更持久的再生反应。
图2. 成年非洲爪蟾的后肢截肢，安装丝水凝胶后后肢再生情况（图源：Science Advances）
多药物治疗增加了截肢后的骨生长和骨重塑
为了表征再生的内部结构，他们分析了骨骼的生长及其模式。
三维CT扫描结果表明，与不进行治疗组相比，多药物治疗组的截肢平面骨生长明显增加。他们进一步分析了骨体积和骨小梁密度等解剖特征，以确定新生骨的复杂性。与其他组相比，MDT治疗的动物显示出更大的骨体积和小梁密度。同时，与其他组别相比，MDT组的骨长度早在截肢后4个月时就开始增加，大约在8个月时出现明显的生长弯曲。这些观察结果共同表明，MDT治疗仅在创面放置24小时，就能诱导显著的骨再生和骨重塑。
图3. 骨骼生长及其模式（图源：Science Advances）
转录组特征分析揭示发育通路的调控
为了深入了解MDT治疗的作用机制，他们在不同时间点对MDT动物与ND动物的早期组织取样，并进行了转录组分析。分析结果显示，与截肢后7天的组织相比，11个小时的组织中的基因表达谱已经发生了显著的变化。利用MDT和ND的显著差异基因，他们富集出了显著上调和显著下调的信号通路。
进一步的基因集富集分析结果显示，组织中前15个高度上调信号通路与神经调节、炎症信号传导和细胞形态发生有关。对神经特异性激活相关基因组的进一步研究表明，脑特异性激酶、神经肽的表达、多巴胺受体和神经球蛋白在截肢后11小时达到峰值，然后在24小时和7天后下降。
有趣的是，他们还观察到Wnt7a，一个参与胚胎前后轴发育的基因，在11小时后上调，在7天时进一步上调；关键的促再生炎症基因，如TGFB、PTGS2、IL1B和FOXP2分别在11和24小时高表达，但在7天后消失。
图5. 基因集富集分析（图源：Science Advances）
周围神经再生和运动功能的恢复
再生医学最终的目的是促进功能恢复，而不仅仅是解剖层面的恢复。因此，研究人员通过评估治疗后18个月动物的运动反应来研究功能的再生。为了确定神经组织的存在，他们进行了免疫组化，用以评估周围神经再生。
与ND或BD组相比，MDT组的神经束数量显著增加，说明MDT治疗促进了神经束的再生和神经支配。此外，MDT组的动物不仅有更多的神经束，而且这些动物的神经束直径也比ND组大得多。
为了评估18个月后动物的功能是否恢复，他们进行了感觉运动评估。他们观察到所有经MDT治疗的动物后肢显示出与正常动物相似的刺激-反应模式。这表明，与损伤前正常功能相比，他们的神经和神经肌肉已经得到了显著的恢复；而未经处理的对照组动物没有显示出任何反应，表明功能严重丧失。这表明生物反应器装置对周围神经提供了有效的支持，并随着时间的推移促进了组织的神经再生，并且该装置与MDT联合进一步促进了再生。
图6. 感觉运动评估（图源：Science Advances）
结语
综上所述，研究人员通过将截肢后的伤口包裹在生物反应器BioDome中，触发了非洲爪蟾的再生过程。BioDome含有一种丝蛋白凝胶，内含五种混合药物，每种药物都有不同的作用，包括抑制炎症、抑制导致瘢痕的胶原蛋白的生成，以及促进神经纤维、血管和肌肉的新生长。这种组合和生物反应器提供了一种积极的信号，使受损组织向再生层面倾斜。
再生的组织和骨骼特征与自然肢体的骨骼结构相似，包含丰富的内部组织（包括神经元），并可以对刺激做出反应。因此，该研究成为恢复完整肢体功能的一个重要里程碑，并提示进一步探索药物和生长因子的组合可能会使得再生的肢体功能更加完整。
本研究第一作者Nirosha J. Murugan博士说：「看到我们选择的药物帮助创造了一个几乎完整的肢体，这是非常令人兴奋的。事实上，只需要短暂的药物接触，就可以启动一个长达数月的再生过程，这表明青蛙和其他动物可能有潜在的再生能力，而这种再生能力是可以被激发的。」
通讯作者Michael Levin教授说：「接下来，我们将测试这种治疗方法是否同样应用于哺乳动物，被BioDome覆盖的开放伤口，可以为启动再生过程提供必要的第一个信号。」
题图来源：来自Flickr，仅用于学术交流
排版|乔维钧
参考资料：
[1]Murugan NJ, Vigran HJ, Miller KA, et al. Acute multidrug delivery via a wearable bioreactor facilitates long-term limb regeneration and functional recovery in adult Xenopus laevis. Sci Adv. 2022 Jan 28;8(4):eabj2164. doi: 10.1126/sciadv.abj2164. Epub 2022 Jan 26. PMID: 35080969.
[2]Joven A, Elewa A, Simon A. Model systems for regeneration: salamanders. Development. 2019 Jul 22;146(14):dev167700. doi: 10.1242/dev.167700. PMID: 31332037; PMCID: PMC6679358.
[3]Johnson GL, Masias EJ, Lehoczky JA. Cellular Heterogeneity and Lineage Restriction during Mouse Digit Tip Regeneration at Single-Cell Resolution. Dev Cell. 2020 Feb 24;52(4):525-540.e5. doi: 10.1016/j.devcel.2020.01.026. PMID: 32097654; PMCID: PMC7186907.
